牡丹油體提取及其穩定性研究

李婷婷 李志遠 孫 靜 陶 俊 趙大球

(揚州大學園藝與植物保護學院，揚州 225009)

油體是由單層磷脂膜包裹液態的三酰甘油(TAG)組合而成，它是植物中儲存油脂的一種亞細胞結構[1]，且存在于幾乎所有積累油的植物組織中。油體密度相較于其它細胞結構最小，因而能夠浮于水溶液表層，易于分離[2]，其可為種子的萌發和幼苗的早期生長發育提供能量，也可臨時存儲同化產物參與碳源的分配[3]。因其類似于天然脂質的作用，油體在食品、藥物和工業產品等行業中應用廣泛，其乳化劑的性質也使得油體在疫苗、化妝品和個人護理產品等方面具有一定的應用[4]。此外，在油體中表達具有較高營養功效的外源蛋白或多肽還可以提高種子的營養成分、改善種子的食用品質、增加植物的附加值[5]。目前，關于植物種子中油體提取的研究已有相關報道。例如，采用水提法可以從大豆中提取穩定的油體[6]；采用Tris-HCl法提取出來的亞麻芥種子油體大小均一且穩定[7]；楊晶等[8]采用PBS作為提取緩沖液，通過去除蛋白質可以得到更加純凈的紅花油體；玉米胚芽采用水萃取提取油體并在初始提取液中應用超濾技術可防止油體聚結，從而提高油體提取率并保持其自然完整性[9]。由此可見，不同植物提取種子中油體的適宜方法并不相同，因此研究不同植物的油體提取方法十分必要。

牡丹是我國的傳統名花，它不僅具有較高的觀賞和藥用價值，還是近些年新興的木本油料作物。牡丹種子富含脂肪酸，其中α-亞麻酸因為人體必備的脂肪酸而備受人們的關注[10]。

目前，關于牡丹籽油的研究主要集中于籽油的提取工藝和精煉技術[10]、脂肪酸成分及理化特性[11]、牡丹籽油的功效[12]等方面。油體作為植物儲存脂質的亞細胞器顆粒，它的正常發育是脂肪酸儲存和積累的前提[13]，相反，脂肪酸的含量與組成也影響著油體的化學與物理性質[14]。油桐油體與脂肪酸的研究就表明其脂肪酸含量與油體發育關系密切[15]。關于牡丹脂肪酸的儲存，尤其是油體方面的研究一直鮮見報道。本研究采用分級法[16]和優化法[17]對牡丹油體進行提取與比較，在獲得相對較好提取方法的基礎之上，對所提取油體在不同溫度、pH、NaCl濃度、糖濃度等條件下的穩定性進行研究，從而對牡丹油體的性質進行了解，便于充分利用牡丹籽油中各類脂肪酸的功能、特性，挖掘牡丹油體在不同領域的應用需求價值。

1 材料與方法

1.1 材料

以栽植于揚州大學牡丹芍藥種質資源圃中的‘鳳丹’為材料，采集花后120天的‘鳳丹’種子用于油體的提取。

1.2 主要儀器與設備

5810R高速臺式冷凍離心機；IX83熒光顯微鏡；CFX96熒光定量PCR儀；60D數碼相機。

1.3 方法

1.3.1 油體的提取

分別采用分級法[16]和優化法[17]提取牡丹種子中的油體。

分級法：稱取大小適中、色澤一致的種子5 g浸泡5 h后用解剖針除去種皮種胚，在種子中加入20 mL研磨液(0.6 mol/L蔗糖，10 mmol/L pH=7.5的磷酸鈉緩沖液)并于4 ℃冰上研磨成勻漿離心，在上層加入20 mL漂浮液Ⅰ(0.4 mol/L蔗糖，10 mmol/L pH=7.5的磷酸鈉緩沖液)，離心后取上層油層加入20 mL去污清洗液(0.1% Tween-20 0.2 mol/L蔗糖，5 mmol/L pH=7.5的磷酸鈉緩沖液)再次離心，在所得上層中加入20 mL磷酸鈉緩液，離心并收集上層油層于離心管中，加入離子洗脫液(2 mol/L氯化鈉，0.6 mol/L蔗糖，10 mmol/L pH=7.5的磷酸鈉緩沖液)20 mL后于上層加入漂浮液Ⅱ(2 mol/L氯化鈉，0.25 mol/L蔗糖，10 mmol/L pH= 7.5的磷酸鈉緩沖液)20 mL后離心。收集油層重懸于20 mL尿素，室溫震蕩后加入20 mL 磷酸鈉緩沖液，離心后收集油層于研磨液中加入己烷混勻，再次離心后去掉上層己烷油層重懸于20 mL研磨液，上層加入20 mL漂浮液離心，最終收集油層于10 mL離心管中備用。

優化法：取新鮮種子5 g，加6倍去離子水膠體磨均，過濾取出上清液4 ℃，10 000 r/min離心30 min。取上浮物溶于5倍加入0.5 mol/L NaCl和0.4 mol/L蔗糖的pH=7.0的Tris-HCl 0.05 mol/L溶液中攪拌過膠體磨20 min后離心。取上浮物加入5倍去離子水，再加入0.1% tween20充分混合，靜置后離心。取上浮物加入2倍己烷混勻后離心，上層油體分離冷藏4 ℃備用。

1.3.2 油體提取方法的比較分析

對采用上述方法提取的油體外觀、提取率、顯微結構、4 ℃條件下儲存兩周的穩定性和油體蛋白組成進行觀察和檢測，從而篩選出相對較好的提取方法。

油體提取率=提取油體的質量/種子的質量×100%

油體顯微結構的觀察:取少量油體，加蒸餾水稀釋后滴在載玻片上，蓋好蓋玻片，放置在熒光顯微鏡(IX83，奧林巴斯株式會社)下采用40倍物鏡觀察其顯微結構并拍照。

油體在4 ℃下儲存兩周的穩定性比較:將利用兩種方法提取出的牡丹油體均放入4 ℃的冰箱中儲存，兩周后取出，將其置于玻片中并觀察、比較其顯微結構。

油體蛋白SDS-PAGE檢測:取兩種方法提取出的牡丹油體樣品各20 μL于EP管內，向其中加入20 μL去離子水后再加入10 μL的5 × Loading buffer，混合均勻后于沸水中煮10 min，制備12%的SDS-PAGE液。蛋白樣品經上樣緩沖液處理后在每孔中加樣10 μL，用12%分離膠進行SDS-PAGE電泳分離，每塊膠的初始電流強度為20 mA，10 min后改為60 mA，當樣品達到膠板底部時結束電泳，用考馬斯亮藍G250染色2 h后脫色拍照觀察。

1.3.3 油體的穩定性研究

取新提取的油體2 mL，分別進行不同溫度和pH值條件下的處理。將量取的油體部分置于50、70、90 ℃的水浴鍋內水浴加熱30 min，另一部分置于用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調節的pH值為5.0、7.0、9.0、11.0的樣品中，處理結束后觀察其顯微結構。

取新提取的油體20 mL，分別用10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)和去離子水(pH=7.0)1∶5稀釋混勻，取前者稀釋過的溶液10 mL依次加入50、100、150、200 mmol/L的NaCl，取后者稀釋后的溶液10 mL以25、50、70、100 mmol/L梯度的糖濃度制備油體懸浮液，后觀察其顯微結構。

2 結果與分析

2.1 油體提取方法的比較

2.1.1 油體外觀和提取率

從外觀上看，兩種方法提取的油體均呈透明狀態，差異不大。但從提取率上來看，分級法提取油體的提取率僅為10.25%，比優化法的提取率低了12.38%。

2.1.2 油體顯微結構及其在4 ℃儲存2周后的穩定性

通過對油體的顯微結構觀察可以發現，兩種方法提取的油體在提取初期都是大小均一、分散均勻、雜質較少、密度大；但將油體在4 ℃儲存2周后，分級法提取的油體出現了大幅度的聚合和皺縮，而優化法提取的油體除少部分粒徑增大外仍然能夠保持相對較好的穩定性(圖1)。

注：a為分級法提取油體的顯微結構；b為分級法提取油體在4 ℃儲存2周后的顯微結構;c為優化法提取油體的顯微結構；d為優化法提取油體在4 ℃儲存2周后的顯微結構。圖1 油體的顯微結構及其在4 ℃儲存2周后的穩定性

2.1.3 油體的SDS-PAGE電泳檢測

對兩種方法提取的油體進行SDS-PAGE電泳檢測，發現2種提取方法對油體中所含的蛋白質種類沒有影響，但與分級法相比，優化法提取油體的條帶顏色顯著較深(圖2)。

注：M為蛋白marker；1為分級法；2為優化法。圖2 兩種方法提取油體的SDS-PAGE電泳檢測

通過對上述油體相關指標的綜合比較，可以發現優化法提取的牡丹油體相對較好，下面將采用優化法提取油體進行穩定性研究。

2.2 油體的穩定性研究

2.2.1 不同溫度對油體穩定性的影響

圖3為50、70、90 ℃條件下的牡丹油體，通過觀察可以發現，隨著溫度的升高，油體出現了不同程度地破裂，但總體上油體依然分散均勻、密度大，雜質也較少、大小均一。

圖3 不同溫度條件下油體的穩定性

2.2.2 不同pH對油體穩定性的影響

由圖4可知，當pH值為5.0和7.0 時，顯微鏡下的油體粒徑相比pH值為9.0和11.0時要明顯增大，油體有顯著聚集現象，形狀不規則均一，甚至存在部分破裂，穩定性顯著下降；當pH值為9.0和11.0時，油體粒徑基本不變，顯微鏡下僅有少數油體聚集，油體較穩定。

圖4 不同pH條件下油體的穩定性

2.2.3 不同NaCl濃度對油體穩定性的影響

由圖5可知，牡丹油體的結構及粒徑隨著NaCl濃度的變化而發生改變。當NaCl濃度為50 mmol/L時，相較于圖2中未經NaCl處理的牡丹油體，其顯微結構沒有發生明顯地變化。當NaCl濃度在100～200 mmol/L時，牡丹油體的粒徑隨著濃度的增加而變大，油體也逐漸開始聚集和破裂，當NaCl濃度增加到200 mmol/L時，牡丹油體已經大面積的破裂和聚集，油體大小不均一，雜質極多，穩定性顯著降低。

圖5 不同NaCl濃度條件下油體的穩定性

2.2.4 不同糖濃度對油體穩定性的影響

圖6顯示牡丹油體的穩定性與糖濃度關系密切。當糖濃度為25 mmol/L時，牡丹油體的結構和粒徑沒有發生明顯地變化，當糖濃度為50 mmol/L時，牡丹油體開始出現小部分的破裂，油體粒徑變大，大小不太均一，當濃度增加到70～100 mmol/L時，牡丹油體大面積破裂和聚集的現象顯著，相較于未處理過的油體，100 mmol/L糖濃度的牡丹油體中出現了超大油體，大小極不均一，雜質極多，穩定性顯著下降。

圖6 不同糖濃度條件下油體的穩定性

3 討論

本研究采用分級法和優化法對牡丹種子中油體進行提取，隨后對油體的外觀、提取率、顯微結構、4 ℃儲存兩周后穩定性和油體蛋白組成等指標進行比較，最終確定了優化法更加適合牡丹油體的提取。單從外觀來看，兩種方法提取的油體均呈透明狀態，差異不大，但分級法提取的油體透明度更高，這可能是由于其在提取過程中的多步的清洗所致。而就提取率而言，優化法的提取率更高，達到22.63%，這主要是由于優化法步驟簡單使得油體提取損耗大大降低，而分級法的多步清洗導致油體提取的回收損耗增加。在SDS-PAGE電泳檢測油體蛋白的結果中，優化法提取油體的條帶顏色較深，這可能是由于分級法操作中在去除雜蛋白的同時也對油體蛋白產生了一定的影響，因此優化法提取的油體蛋白含量要高于分級法，這也可能是優化法的油體提取率要高于分級法的原因。此外，在4 ℃儲存兩周后經顯微觀察可知，分級法提取的油體出現了大幅度的聚合和皺縮，而優化法提取的油體依舊大小均一、分布均勻，具有較好的穩定性。

油體的穩定性是由其表面的油體蛋白決定的，油體表面存在電荷，當離油體蛋白等電點較近時，油體表面的靜電荷接近于零，油體之間會因靜電聚合作用而發生聚集，從而導致油體粒徑增大，形狀不規則；反之油體不發生聚集，具有較好的穩定性[7]。而油體的穩定性容易受到外界環境的影響，例如溫度、pH值、NaCl和糖濃度等[18]。本研究的結果顯示，溫度對于牡丹油體的影響不大，在50、70、90 ℃條件下，油體均能保持相對穩定，這與花生油體穩定性的研究結果相一致[19]。有研究推測，油體上的油體蛋白與TAG形成“發卡結構”[20]，在外界溫度條件升高時，油體蛋白的頭部伸入到TAG內部而免受破壞，因此油體在溫度變化的條件下依舊能保持較好的穩定性。高紅桃等[7]關于亞麻芥種子油體的穩定性研究表明，油體本身帶負電荷，以偏堿性的條件處理會使靜電荷量增加，油體之間因斥力較大而能保持平衡且不發生聚集，相反，在酸性及中性條件下，油體之間因斥力小而容易出現聚集甚至破裂的現象，使其粒徑變大。本研究也證實了pH的變化對牡丹油體的穩定性有一定的影響。當pH≥9.0時，牡丹油體穩定分布；pH≤7.0時牡丹油體穩定性被破壞，尤其是當pH為5.0時，油體粒徑顯著增大；7.0

本研究通過比較確定了優化法為適合牡丹油體提取的方法，并從溫度、pH值、NaCl和糖濃度等幾個因素其研究油體的穩定性，通過對牡丹油體性質的研究，充分了解和利用牡丹籽油中各類脂肪酸的功能、特性，挖掘牡丹油體在食品、藥品、化妝品和個人護理產品等不同領域的應用需求價值。

4 結論

通過對兩種牡丹油體提取方法的比較研究，得出優化法更適宜于牡丹油體的提取。在牡丹油體的穩定性研究中，溫度、pH值、NaCl和糖濃度對其影響不一，即：溫度對牡丹油體的穩定性影響不大，牡丹油體在中性和酸性條件下(pH≤7.0)穩定性容易受到破壞，牡丹油體在低濃度的NaCl(50 mmol/L)和糖(25 mmol/L)條件下能夠表現穩定。