桑葉粉和桑葉精油對赤擬谷盜的驅避效應及主要揮發性成分的GS-MS分析鑒定

徐雯雯 吳珊珊 鄧利玲,3 何 運 鐘 耕,2

(西南大學食品科學學院1, 重慶 400715) (西南大學食品科學與工程國家級本科實驗教學示范中心2，重慶 400716) (重慶市生物技術研究所有限責任公司3，重慶 401121)

桑葉別名蠶葉或鐵扇子，為?？?Moraceae)植物桑(MorusalbaL.)的樹葉。桑葉中富含黃酮類、多糖類、生物堿類、植物甾醇類、維生素、氨基酸等多種化合物，具有降血糖、降血脂、抗衰老、抗腫瘤、抗菌、清肺潤燥、防止動脈粥樣硬化、美白養顏等藥理功效，因此被廣泛應用在食品、保健品和藥物研發等領域[1]。

有研究發現，植物在生長過程中，葉片中的貯存位點會合成和釋放低分子量的次生代謝物，包含烴、醇、醛、酮、酯和萜烯類化合物，構成了不同類型植物的特征揮發性氣味[2]。這類特殊的香氣成分不僅可以作為識別不同植物的指紋圖譜，同時在植物與宿主和非宿主昆蟲之間的誘集和驅避關系上扮演著重要的化學信號的作用[3]。通過研究植物揮發性成分中各類化合物對目標昆蟲的響應作用，并將這些有效成分提取出來，開發成綠色、環保、不易產生抗性、原料來源廣泛的昆蟲信息素誘捕劑和儲糧害蟲防護劑或殺蟲劑，是近年來植源性生物防治儲糧害蟲手段的主要研究方向[4]。

重慶是中國典型的受亞熱帶季風氣候控制的南方城市，夏季氣溫高、濕度大，面粉在這樣高濕高溫的環境下儲藏、運輸和銷售，極易感染儲糧害蟲赤擬谷盜[5]。在面制品的儲藏過程中發現，添加桑葉粉制作的掛面在經過了一個夏季的儲藏后，并未感染赤擬谷盜，而處在同一環境下的其他傳統掛面制品卻遭受不同程度的蟲害感染。據此現象展開了討論和文獻查閱，認為桑葉中可能含有可以驅避赤擬谷盜或抑制害蟲種群生長繁殖的特殊成分，但由于目前國內外鮮見此類現象的解釋和報道，故本次試驗對桑葉中的主要驅蟲成分做了鑒定，為后續進一步探究各類化合物對赤擬谷盜的驅避效應提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

鮮桑葉(秋成熟葉)：2016年10月采摘于四川省大竹縣，去其葉柄，洗凈、瀝干后于5～8 ℃儲藏。鮮桑葉的干燥采用熱泵干燥技術進行。

供試害蟲赤擬谷盜由西南大學植物保護學院提供。將面粉與干酵母粉按質量比10 ∶1混勻后分裝于滅菌的玻璃罐頭瓶中，接入赤擬谷盜成蟲后于溫度(27±1) ℃、相對濕度(75±5)%、黑暗的人工氣候箱中培養，7 d后篩去成蟲，待下一代成蟲大量出現后約5～7 d，篩出成蟲供試[6,7]。

1.2 試驗試劑

丙酮、無水乙醇等均為分析純。

1.3 試驗儀器

DHG9070A型鼓風干燥箱；YG-KRK熱泵烘干機；WX-95 II型超微振動研磨機；DYF-300型中藥粉碎機；PYX-300Q-A人工氣候箱；GCMS-2010型氣相色譜質譜聯用儀；0.5～10 μL、100～1000 μL型單道可調式移液器；57330-U[PDMS (100 μm)]手動固相微萃取進樣器；IKA RCT型磁力攪拌器；同時蒸餾萃取器。

1.4 試驗方法

1.4.1 桑葉粉的制備和分級

將預先處理好的新鮮桑葉放入熱泵干燥機中，裝料量為1.5 kg/m2、干燥溫度為60 ℃、相對濕度為44%、干燥時間為6 h。烘干后再轉入中藥粉碎機中粉碎，分別過60 、100 、180 、240 目的標準篩，將桑葉粉按粒度大小分為3 個等級[8]：60～100目為粗粉，100～240 目為細粉；取一部分細粉，經超微振動研磨機粉碎2 h后再過500 目篩，得到超微粉，供試。文中所涉及的桑葉粉均指經超微粉碎處理后的桑葉粉。

1.4.2 同時蒸餾萃取法(SDE)提取桑葉粉中的精油

稱取100 g桑葉粉置于2 000 mL燒杯中，加入800 mL蒸餾水，磁力攪拌1 h(800 r/min)，直至分散均勻后，將溶液轉入2 000 mL圓底燒瓶中，另用200 mL蒸餾水潤洗燒杯，并將濾液合并至燒瓶中，放入5粒玻璃沸石，與同時蒸餾萃取器較低一端的接口連接，置于數顯調溫式電熱套中，另一端與裝有100 mL丙酮的250 mL燒瓶相連，置于水浴鍋中(暫未加熱)。桑葉粉混合液的加熱分為兩個階段：升溫至130 ℃，待2 000 mL燒瓶中的桑葉溶液開始產生大量泡沫后立即停止加熱，待溶液溫度下降泡沫消失后，再重新開啟電熱套，升溫至155 ℃。當U型管中的液體開始上升后，打開水浴鍋并設定水浴溫度為50 ℃，保持冷凝水的持續循環，提取4 h。

萃取完畢后，將U型管中的混合液與燒瓶中剩余的有機溶液合并，靜置分層后用分液漏斗將其分開，將所得的有機相在50 ℃的水浴鍋中恒溫水浴30 min左右，待大量丙酮揮發完畢，樣品體積約1～2 mL，顏色呈淡黃色，即得桑葉精油的丙酮濃縮液，將試管封口放入4 ℃冷藏室備用。

1.4.3 赤擬谷盜的驅避試驗

采用區域偏好法[9]，分別考察不同添加量的桑葉粉和不同濃度的桑葉精油對赤擬谷盜的驅避效果，驅避率的計算參考徐小青等[10]、呂建華等[11]的方法。

桑葉粉：分別稱取桑葉粉1、2、3、4、5 g，均勻鋪撒在培養皿(d=90 mm)的半側(中間用等直徑長的薄木片隔開，防止桑葉粉朝另一側擴散)，待桑葉粉添加完畢后，輕輕取出木片，向各培養皿中加入赤擬谷盜成蟲40頭，加蓋并做好標記?？瞻捉M的培養皿不做任何添加，直接放入40頭赤擬谷盜成蟲，將所有處理好的培養皿放入溫度(27±1) ℃、相對濕度(75±5)%、黑暗的人工氣候箱中，于1 、6 、12 、24 、36 、48 h，統計兩側蟲體的分布情況，每組試驗平行測定3次。

桑葉精油：將若干組桑葉精油的丙酮濃縮液合并至一支普通試管中，并在50 ℃的水浴鍋中恒溫20 min左右，待丙酮揮發完畢后(以每5 min前后兩次稱量的質量差小于0.01 g且精油顏色呈棕褐色為準)，用移液槍(0.5～10 μL)分別吸取桑葉精油2、4、6、8、10 μL于試管中，再向各試管中加入適量無水乙醇配制體積濃度(V/V)為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的精油乙醇溶液。在培養皿(d=90 mm)中，放入對半折疊的濾紙片，分別吸取各濃度的精油溶液400 μL，均勻滴加在濾紙片的半面，另一半面不做處理，對照組以400 μL無水乙醇做相同處理，敞口干燥1～2 min后，向各培養皿中加入赤擬谷盜成蟲40頭，加蓋并做好標記，放入溫度(27±1) ℃、相對濕度(75±5)%、黑暗的人工氣候箱中，于1、6、12、24、36、48 h，統計兩側蟲體的分布情況，每組試驗平行測定3次。驅避率計算公式：

PR= [(Nc-Nt) / (Nc+Nt)]×100%

式中：PR為驅避率；Nc為對照面上的蟲數；Nt為處理面上的蟲數。驅避率取三次試驗的平均值，根據大小劃分為Ⅴ個等級[7]：Ⅰ級：0.1

1.4.4 桑葉粉和桑葉精油的氣味成分萃取

采用頂空固相微萃取法：準確稱取桑葉粉6 g加入到20 mL萃取瓶中，擰緊瓶蓋后將其固定放置于50 ℃水浴鍋中，插入經老化的萃取針，平衡5 min后推出萃取針頭，頂空萃取20 min后將萃取頭插入GC-MS進樣口，解析5 min。

用單道可調移液器準確吸取精油稀釋液1 000 μL，注入20 mL萃取瓶中，敞口置于50 ℃水浴鍋中，穩定10 min左右，待瓶中的丙酮溶劑揮發完畢后，再加蓋密封，插入經老化的萃取針，平衡5 min后推出萃取針頭，頂空萃取20 min后將萃取頭插入GC-MS進樣口，解析5 min。

1.4.5 桑葉粉和桑葉精油的GC-MS分析條件

桑葉粉色譜條件：色譜柱為DB-5MS(30 mm×0.25 mm，0.25 μm)；柱箱溫度：40 ℃，進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：40 ℃保持5 min，以4 ℃/min升至90 ℃，保持1 min，再以3 ℃/min升至150 ℃，最后以10 ℃升至230 ℃；載氣(He)：流速1.00 mL/min，壓力53.5 kPa，進樣量1 μL，不分流。

桑葉粉質譜條件：電離方式：電子電離(electron ionization，EI)源；離子源溫度230 ℃；接口溫度230 ℃；溶劑延遲時間1 min；質量掃描范圍m/z35～500；掃描速度1 000 u/s。

桑葉精油色譜條件：色譜柱為DB-5MS(30 mm×0.25 mm，0.25 μm)；柱箱溫度：50 ℃，進樣口溫度：230 ℃；升溫程序：40 ℃保持1 min，以20 ℃/min升至90 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至120 ℃，保持5 min，接著以3 ℃升溫至180 ℃，保持1 min，最后以10 ℃/min升至230 ℃；載氣(He)：流速1.00 mL/min，壓力53.5 kPa，進樣量1 μL，不分流。

桑葉精油質譜條件：溶劑延遲時間3 min，其余條件同上。

利用Nist 2008譜庫檢索法進行定性分析，相似度不低于85%的認為是可信的，查閱各峰對應的CAS號進一步確定各組分信息，最后利用峰面積歸一法確定各種香氣成分的相對含量。

1.4.6 數據處理

2 結果與分析

2.1 桑葉粉和桑葉精油對赤擬谷盜的驅避試驗結果

由圖1可知，隨著添加量的增加，桑葉粉對赤擬谷盜的驅避作用不斷增強，6 h內5 g桑葉粉處理組(單位面積的桑葉粉質量為157.2 mg/cm2)的驅避率達到了Ⅴ級以上，表明驅避效果顯著。隨著時間的延長，驅避率不斷下降，24 h各處理組與空白組的驅避率無顯著性差異(P>0.05)。在24 h至48 h期間，各試驗組的驅避率雖出現波動，但多數均集中在[-20%，20%]區間，表明驅避作用基本消失，赤擬谷盜在培養皿中呈現隨機的自然分布。

由圖2可知，桑葉精油對赤擬谷盜的驅避作用隨著精油濃度的增大而不斷增強。精油濃度為1%和0.8%的兩個處理組(單位面積的精油體積分別為0.125 8、0.100 6 μL/cm2)，6 h內驅避等級均在Ⅴ級以上。在12 h時，1%濃度的精油稀釋液對赤擬谷盜的平均驅避率仍大于80%，表明驅避效果明顯。隨著時間的延長，桑葉精油逐漸揮發，驅避作用不斷下降，24 h后，各處理組與空白組的驅避率無顯著性差異(P>0.05)。36 h后各處理組的驅避率均低于20%，表明驅避作用基本消失，赤擬谷盜在培養皿中呈現隨機的自然分布。

圖1 不同添加量的桑葉粉對赤擬谷盜的驅避作用

圖2 不同濃度的桑葉精油對赤擬谷盜的驅避作用

比較圖1和圖2可知，桑葉粉和桑葉精油在濃度較高的情況下，短時間內(6 h)對赤擬谷盜具有顯著的驅避效果(PR≥80%)，但兩種物質的緩釋效果均不太理想，導致驅避率隨著時間的延長而不斷降低。為了進一步篩選和鑒定出桑葉粉和桑葉精油中對赤擬谷盜具有顯著驅避效果的成分，采用頂空固相微萃取法，對桑葉粉和桑葉精油中的主要揮發性成分進行了氣相色譜-質譜聯用分析。

2.2 桑葉粉和桑葉精油的揮發性成分分析結果及對比

采用頂空固相微萃取法(HS-SPME)對干燥的桑葉粉和桑葉精油中揮發性成分進行萃取，經氣相色譜-質譜聯用儀解析得總離子流色譜圖(圖3)，將TIC中的峰信息注冊到質譜處理表中執行相似度檢索，根據CAS號確定各物質名稱，并繪制表格(表1)。

表1 桑葉粉及精油中氣味成分的GC-MS分析結果

續表1

續表1

注：“-”表明未檢出。

如表1所示，經HS-SPME法吸附的桑葉粉揮發性成分中，化合物種類的組成主要有醇類(32.2%)、烯烴類(21.36%)、酯類(18.06%)、醛類(8.45%)、酮類(4.6%)和烷烴類(4.07%)等。其中醇類物質有13種，含量較高的成分包括葉醇(11.67%)、L-2-甲基丁醇(4.56%)、正己醇(3.98%)、順-2-戊烯-1-醇(3.73%)、1,5-己二烯醇(2.91%)、芳樟醇(1.60%)、辛醇(1.46%)；

圖3 氣味成分總離子流色譜圖

烯烴類物質有4種，以檸檬烯(14.98%)和月桂烯(5.16%)的含量最高；酯類物質共有13種，相對含量較高的成分有己酸己酯(5.27%)、乙酸乙酯(4.84%)、丁酸丁酯(2.39%)、己酸乙酯(1.81%)和辛酸乙酯(1.08%)；醛類物質有5種，主要有2-甲基丁醛(4.49%)、天然己醛(1.91%)和辛醛(1.02%)；以及以3-羥基-2-丁酮(3.69%)為主的酮類物質3種，以十五烷(0.68%)、金合歡烷(0.63%)和正十六烷(0.58%)為主的烷烴11種。

如表1所示，在同時蒸餾萃取法(SDE)制備的桑葉精油中，由HS-SPME解析出的揮發性化合物種類主要有酮類(42.1%)、酯類(20.79%)、醇類(8.88%)、酚類(4.79%)、醛類(3.92%)、烷烴類(3.61%)、烯烴類(2.3%)和其他類(2.25%)等。其中酮類物質有14種，含量較高的成分包括香葉基丙酮(13.51%)、β-紫羅蘭酮(12.26%)、α-紫羅蘭酮(3.2%)、大馬酮(2.59%)、植酮(1.09%)、六氫假紫羅酮(0.94%)、法尼基丙酮(0.9%)等；酯類物質有6種，主要成分為苯甲酸己烯酯(14.44%)、苯甲酸正己酯(2.86%)以及(E,Z)-2-己烯酸-3-己烯酯(2.04%)；醇類物質共有6種，相對含量較高的成分有反式-橙花叔醇(4.92%)和植醇(1.2%)；酚類物質僅2種，分別為2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)(2.87%)和2,4-二特丁基苯酚(1.92%)；醛類物質有8種，除(Z)-4-庚烯醛(0.94%)和青葉醛(0.89%)外，其余成分的相對含量較低；烷烴類物質4種，主要為丙烯基環庚烷(1.77%)和正十六烷(1.2%)；而其他類化合物中主要是雜環類衍生物和有機酸。

由圖3對比可知，桑葉粉中揮發性成分的保留時間相對較短，表明其含有的物質多以相對分子質量較低的弱極性化合物為主，相比之下，桑葉精油中揮發性成分的保留時間較長且更集中，說明其含有的物質多以分子量較大的極性化合物為主且各化合物之間的相對分子質量差異較小。

由表1可知，桑葉粉中含有較多的萜烯類化合物，相對含量達到26.2%，其中包括半萜烯(順-2-戊烯-1-醇)、單萜烯(檸檬烯、月桂烯、芳樟醇、D-薄荷醇)，倍半萜烯(α-法尼烯)等。此外，含量較多(18.06%)的酯類物質，也是構成桑葉天然清香味的重要組成成分[12]。在桑葉精油中，萜烯類化合物的種類也比較豐富，有5,6-二乙基-環己-1,3-二烯、α-法尼烯、反式-橙花叔醇、植醇、金合歡醇、香葉醇、β-環檸檬醛等，但總的相對含量(8.82%)較提取前的桑葉粉(26.2%)有明顯下降。桑葉精油中酮類化合物(42.1%)比桑葉粉中的酮類化合物(4.6%)占有更大的比重，這可能是由于在高溫提取精油的過程中，桑葉粉中醇類化合物的仲醇基團脫氫氧化后生成酮引起的，這與表中的醇類物質相對含量從提取前的32.2%下降到8.88%是一致的。另外烯烴類物質的相對含量也從提取前的21.36%下降到2.3%，這可能與高溫下雙鍵中的π鍵斷裂，發生環氧化和加成反應有關[13]。

2.3 桑葉粉和桑葉精油的主要揮發性成分討論

在桑葉粉和桑葉精油中，揮發性成分相對含量較高(≥10%)的五種化合物包括葉醇(11.67%)、檸檬烯(14.98%)、香葉基丙酮(13.51%)、β-紫羅蘭酮(12.26%)、苯甲酸己烯酯(14.44%)。

對葉醇(又名青葉醇，Leaf Alcohol)在生物防治領域有相關的研究報道表明，其會對不同類型的昆蟲提供警報或者集結等信息素的作用。例如對于樹皮甲蟲而言，來自非宿主樹皮和樹葉中的1-辛烯-3-醇、葉醇、1-己醇等揮發性成分能夠干擾它們的嗅覺、為甲蟲提供警報信息，從而減少針葉樹被侵染的風險[15]。Joachim Ruther等[16]發現苯醌可以協同增強葉醇對雄性金龜子的引誘作用，且不會受到殺蟲劑氯氟氰菊酯添加量的影響，為大面積誘殺此類森林害蟲提供了一條可行的途徑。

在生物防治領域，將檸檬烯(又名苧烯或苧烯，D-Limonene)開發為一種潛在的害蟲殺滅劑的研究起步較早，何翠娟等[17]利用d-檸檬烯強力的脫酯和滲透性，破壞昆蟲體表的蠟質防水保護層，導致體內氣孔堵塞，進一步降低昆蟲獲取氧氣的能力，最終造成昆蟲的失水窒息死亡。樊瑛等[18]通過研究幾種柑桔皮的有機溶劑提取物對蚜、螨類害蟲的殺蟲活性發現，以檸檬烯為主要成分的提取液對截形葉螨、山楂葉螨、紅花指管蚜、豆蚜等害蟲均有較強的殺滅效果。還有報道顯示[19]，在美國有關于采用柑桔精油的萜烯類化合物(主要成分為檸檬烯)配制殺蟲劑的專利，其配方為3.5～4.5%的表面活性劑與4～7%的檸檬烯，加水混勻后，可有效殺死各類小害蟲如飛虱、臭蟲、蚊子等。

香葉基丙酮[(5E)-6,10-二甲基-5,9-十一碳二烯-2-酮，Geranylacetone]在植物-昆蟲間的相互作用中扮演著重要角色，他們不僅具有驅避昆蟲的功效，而且還是一些生物信息素的合成前體。W Lwande等[20]研究了白花菜精油中的主要揮發性成分，篩選出其中相對含量最高的28種單體化合物，并探究了不同濃度下的精油和單體成分對家畜蜱蟲的驅避效果，發現包括香葉基丙酮在內的幾種高濃度單體成分較同濃度下的陽性對照組避蚊胺對蜱蟲具有同樣顯著的驅避作用。MG Fonseca等[21]通過頂空固相微萃取法分析發現，香葉基丙酮和另外單體成分，是構成山葵甲蟲性信息素的特異性化合物，而且三種單體的混合物在宿主植物存在時會對甲蟲產生更強的引誘作用。

低濃度的β-紫羅蘭酮(又名香堇酮或β-芷香酮，β-Ionone)溶液能夠對馬鈴薯塊莖蛾的產卵率產生一定的抑制作用[22]；張萌等[23]人采用熒光、UV和圓二色譜等技術探究了Q型煙粉虱化學感受蛋白CSP1與β-紫羅蘭酮的親和作用和猝滅機理，從分子水平上進一步解釋了Q型煙粉虱對番茄等宿主植物具有偏嗜性的機理和原因。李姝等[24]使用Y型嗅覺儀研究了13種植物揮發性物質對煙粉虱雌、雄成蟲的趨避作用，結果發現β-紫羅蘭酮對雄蟲的吸引作用較雌蟲更為顯著。涂蓉等[25]采用Y型嗅覺儀和觸角電位技術(EAG)，記錄了桔小實蠅在交配前后對10中寄主果實揮發性成分的反應，結果發現β-紫羅蘭酮、α-法呢烯、大根香葉烯等能夠引起桔小實蠅的EAG反應，在生物防治中具有開發為昆蟲引誘劑的潛在價值。

在生物防治領域有關苯甲酸己烯酯(又名苯甲酸葉醇酯，cis-3-Hexenyl Benzoate)的報道較少。鄧思思[26]通過熒光競爭結合試驗，探究了華北大黑鰓金龜的氣味信息素結合蛋白OBP1和OBP2對73種氣味分子的結合能力，發現苯甲酸酯類與它們具有較好的親和力，可能對害蟲具有誘集作用。

以上5種桑葉粉和桑葉精油中的主要揮發性成分，在GB 2760—2014《中國食品安全國家標準食品添加劑使用衛生標準》中均被納入允許使用的食品用合成香料名單，各香料的編碼為：葉醇S0027、檸檬烯S0654、香葉基丙酮S0261、β-紫羅蘭酮S0235、苯甲酸葉醇酯S0490。

3 結論

分別考察了桑葉粉和桑葉精油對赤擬谷盜的驅避作用，結果顯示，驅避作用隨處理濃度的增大而增強，隨時間的延長而逐漸降低。6 h內，5 g的桑葉粉(單位面積質量濃度為157.2 mg/cm2)對赤擬谷盜的驅避率在80%以上，驅避等級達到Ⅴ級，驅避效果顯著；12 h內，濃度為1%和0.8%的桑葉精油(單位面積體積濃度分別為0.125 8、0.100 6 μL/cm2)對赤擬谷盜的驅避率大于80%，驅避等級達到Ⅴ級，驅避效果顯著。

采用頂空固相微萃取法(HS-SPME)分別對桑葉粉和桑葉精油中揮發性成分進行提取，利用氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用儀進行解析，結果顯示，桑葉粉中共鑒定出50種揮發性化合物，包括醇類(32.2%)、烯烴類(21.36%)、酯類(18.06%)、醛類(8.45%)、酮類(4.6%)和烷烴類(4.07%)，其中相對含量最高的兩種化合物為d-檸檬烯(14.98%)和葉醇(11.67%)；桑葉精油中共鑒定出49種揮發性化合物，包括酮類(42.1%)、酯類(20.79%)、醇類(8.88%)、酚類(4.79%)、醛類(3.92%)、烷烴類(3.61%)、烯烴類(2.3%)和其他類(2.25%)，其中相對含量最高的三種化合物為苯甲酸己烯酯(14.44%)、香葉基丙酮(13.51%)和β-紫羅蘭酮(12.26%)。

篩選出了桑葉粉和桑葉精油中相對含量較高(≥10%)的五種化合物，分別為葉醇(11.67%)、檸檬烯(14.98%)、香葉基丙酮(13.51%)、β-紫羅蘭酮(12.26%)和苯甲酸己烯酯(14.44%)。