美拉德反應產物與不同防腐劑抑菌性能的對比研究

章銀良，李鑫，蔡亞玲

(1.鄭州輕工業學院 食品與生物工程學院，鄭州 450001；2.食品生產與安全河南省協同創新中心，鄭州 450001)

防腐劑(Preservative)是指天然或合成的能夠殺滅或抑制微生物生長和化學變化引起的腐敗的物質[1]。通常根據防腐劑的來源可以將其分為天然防腐劑和化學防腐劑兩大類[2,3]。其主要是通過破壞微生物正常的新陳代謝，使微生物蛋白質凝固和變性，抑制其體內的酶類和代謝產物的排除，導致其失活，因此其被廣泛應用于肉類、油脂、火腿、方便面等食品中。目前，在食品防腐保鮮過程中，主要添加的是化學防腐劑，但是由于化學防腐劑的使用不當所引起的致癌、致畸、食品中毒等問題頻發，以及消費者對食品安全問題的關注程度日益高漲，所以探索抑菌效果好、無毒性的天然防腐劑成為食品領域研究的熱點問題之一[4-7]。

為了避免使用合成防腐劑，近年來，許多研究者已開發出一些天然提取物，如：精油、香酚乙酸酯、丁香酚、乳酸鏈球菌素(Nisin)、溶菌酶、納他霉素等[8-12]。盡管低濃度的溶菌酶、納他霉素和精油在體外研究中是有效的，但在食物基質中需要更高的濃度以達到相當的效果，并且它們的抗菌廣譜性較受限制[13]。

此外，精油的使用會對腌制食品的風味產生很大影響[14]。與此同時，一些研究人員探索發現了具有抗微生物作用的美拉德反應產物(MRPs)也可作為天然防腐劑，當羰基化合物如還原糖與游離或蛋白質結合的氨基酸反應時會形成MRPs，例如在牛奶或烘焙產品的熱加工過程中或在咖啡或可可豆的烘焙過程中[15]。

近年來，已經研究了來自模型混合物(氨基酸和還原糖的加熱溶液)或來自食物提取物的MRPs的抗微生物作用。因此，檢測到來自模型混合物的MRPs對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、嗜水氣單胞菌或幽門螺桿菌等不同菌株的抗菌活性以及針對酵母的抗菌活性[16-18]。

本文主要將MRPs與2種化學防腐劑山梨酸鉀、雙乙酸鈉及3種天然防腐劑乳酸、乳酸鈉、Nisin(乳酸鏈球菌素)進行對比研究，以評估它們在抑菌廣譜性、抗微生物活性方面的優劣差別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-賴氨酸、D-果糖、L-精氨酸、D-葡萄糖：生化試劑，Solarbio試劑公司；山梨酸鉀、雙乙酸鈉、乳酸鈉、乳酸、Nisin(乳酸鏈球菌素)：食品級，山東優索化工科技有限公司；蛋白胨、氯化鈉、酵母粉、瓊脂：北京奧博星生物技術有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇：分析純，國藥集團有限公司；去離子水。

1.1.1 指示菌

細菌：枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisBNCC188080)、大腸桿菌(Trans·T1、Top10、BL21)；真菌：酵母菌(MQ3-23、MQ1-23、MQ3-21、MQ3-18)、釀酒酵母(SaccharomycescarlsbergensisACCC20032)。

以上9種受試菌株均來自本實驗室。

菌懸液的制備：細菌在37 ℃下搖床培養約2 h，真菌在28 ℃下搖床培養約4.5 h，得到濃度為(1.0～5.0)×106CFU/mL的菌液。

1.1.2 指示菌培養基

YPD培養基：蛋白胨2%，酵母粉1%，葡萄糖2%，瓊脂1.5%～2%。

LB培養基：NaCl 1%，蛋白胨1%，酵母粉0.5%，瓊脂1.5%～2%。

1.2 儀器與設備

牛津杯(內徑6.0 mm，外徑8.0 mm，高10.0 mm)；檢測專用培養皿(內徑90 mm，高15 mm)；美國Rainin瑞寧Pipet-Lite XLS移液槍 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；YZJ-SCT121超凈工作臺 東莞市華旗凈化工程有限公司；SQP電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；DNP-9162BS電熱恒溫培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司；HJ-3恒溫磁力加熱攪拌器 常州國華電器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 廣州越特科學儀器有限公司；pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；HH-1智能型數顯恒溫油浴槽 鞏義市予華儀器有限責任公司；101-2型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 抑菌效果最佳的MRPs制備

依據前期均勻試驗以及單因素試驗比較分析優化得出制備MRPs的最佳反應條件和反應原料。參考章銀良等[19]的方法，準確稱取D-葡萄糖3.6032 g和L-精氨酸10.4520 g(摩爾比1∶3)，溶解于90 mL的去離子水中，置于恒溫磁力攪拌器上攪拌至溶液清澈，再用3 mol/L的HCl和3 mol/L的NaOH調整溶液pH至12.0，最后將調好的pH值為12.0的溶液定容至100 mL，混合均勻后，取10 mL反應液轉移到25 mL具塞試管中，旋緊試管后，置于120 ℃恒溫油浴鍋中反應210 min，反應結束后置于冰水中冷卻。再準確稱取D-果糖10.8096 g和L-賴氨酸2.9238 g(摩爾比3∶1)溶解于90 mL的去離子水中，制備條件為加熱時間90 min、反應初始pH值調至10.0、溫度120 ℃，其余制備步驟同上。

1.3.2 MRPs與不同種類防腐劑抑菌效果的研究

1.3.2.1 牛津杯法測定抑菌活性

參考Makhlouf-Gafsi I等[20]、張建華等[21]的方法，在無菌條件下，將經過高壓蒸汽滅菌的固體培養基(真菌用YPD培養基，細菌用LB培養基)冷卻至40～45 ℃之間，倒6組平板，每組9個。取40 μL濃度為(1.0～5.0)×106CFU/mL的菌液轉移至固體培養基平板表面并用無菌涂布棒涂布均勻。用移液槍分別吸取MRPs、乳酸、山梨酸鉀、雙乙酸鈉、乳酸鈉、Nisin(防腐劑濃度均按國標最大限量配制)各200 μL加入擺放于固體培養基中央的牛津杯內(細菌加入果糖和賴氨酸MRPs，酵母菌加入葡萄糖和精氨酸MRPs)，同時做試劑空白對照。放入恒溫培養箱中平板倒置培養，測量抑菌圈直徑，并計算3次平行試驗的平均值。

1.3.2.2 抑菌率的測定

參照楊曉韜等[22]、顧勝等[23]的方法，首先將5種防腐劑分別按國標最大限量的100%進行配制，用無菌水配制并且都在無菌操作臺中操作。在含有5 mL液體培養基的試管中，實驗組加入200 μL防腐劑溶液、40 μL菌懸液；陽性對照組用無菌水代替防腐劑，陰性對照組只加入液體培養基和防腐劑(用比濁法調零，菌落總數法只做陽性對照)。

菌落總數法[24]：用于乳酸、MRPs、Nisin抑菌活性的測定。用稀釋不同濃度梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)的菌懸液分別制備上述混合液，之后各取200 μL涂平板，真菌于28 ℃下培養48 h，細菌于37 ℃條件下培養24 h，計數，與陽性對照比較，并用于表征各種防腐劑的抑菌活性。

比濁法[25]：用于山梨酸鉀、雙乙酸鈉、乳酸鈉抑菌活性的測定。將上述體系充分混勻后，真菌于28 ℃下培養48 h，細菌于37 ℃下培養24 h。取出試管，充分振蕩，并對各個試管進行逐一檢查，觀察每個試管的渾濁度。以陰性對照作為空白參比，用紫外分光光度計于適宜波長處(真菌培養液在560 nm處測量，細菌培養液在600 nm處測量)測定培養液的濁度(OD 值)，與陽性對照比較，并用于表征各種防腐劑的抑菌活性。

菌落總數法抑菌率的計算：

抑菌率(%)=(1-實驗組菌落數/陽性對照菌落數)×100。

(1)

比濁法抑菌率的計算：

抑菌率(%)=(1-實驗組OD值/陽性對照OD值)×100。

(2)

1.3.2.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定

MIC的測定[26,27]：首先根據防腐劑5種水平添加量(國標限量的0%、20%、40%、60%、80%、100%)的抑菌率初步確定其MIC范圍，在此百分比下設定密集的稀釋濃度梯度(稀釋2，4，8，16，32，64，128，256，512，1024倍)，培養后涂布平板測定其菌落總數，選擇無菌落生長(即抑菌率為100%)時的防腐劑質量濃度，即為防腐劑的最小抑菌濃度(MIC)。

2 結果與分析

2.1 牛津杯法測定抑菌活性結果對比

以抑菌圈直徑作為抑菌活性指標，測定MRPs與不同種類的防腐劑(天然防腐劑與化學防腐劑)對不同菌種的抑制效果，分別用SPSS 19.0軟件進行數據處理，試驗結果見表1和表2。

表1 MRPs與防腐劑對不同真菌的抑菌圈直徑

注：表中“-”表示抑菌圈直徑Φ≤8 mm，無明顯抑菌作用；同一行中，不同字母表示差異顯著(p<0.05)，相同字母表示差異不顯著(p>0.05)。

表2 MRPs與防腐劑對不同細菌的抑菌圈直徑Table 2 The inhibition zone diameters of Maillard reaction products and preservatives to different bacteria

注：表中“-”表示抑菌圈直徑Φ≤8 mm，無明顯抑菌作用；同一行中，不同字母表示差異顯著(p<0.05)，相同字母表示差異不顯著(p>0.05)。

經過方差分析和多重比較，觀察對5種真菌的抑菌效果，由表1可知6種防腐劑對5種酵母菌的抑菌作用大小為：山梨酸鉀>葡萄糖+精氨酸MRPs>乳酸>乳酸鈉>雙乙酸鈉>Nisin，其中，葡萄糖+精氨酸MRPs僅次于山梨酸鉀，對MQ3-21、MQ3-23、MQ3-18、MQ1-23、釀酒酵母的抑菌圈直徑分別達到(22.76±0.25)，(20.25±0.18)，(20.56±0.54)，(23.89±0.71)，(21.55±0.36) mm，可以看出MRPs擁有能與化學防腐劑相媲美的抑菌效果，同時在抑菌廣譜性方面又優于天然防腐劑乳酸鈉；乳酸和乳酸鈉2種防腐劑對MQ3-21、MQ3-23、MQ3-18、MQ1-23的抑菌效果有差異但不明顯，但對于釀酒酵母的抑菌效果相差較大，乳酸對其抑菌圈直徑達到(28.42±0.23) mm，而乳酸鈉對其無明顯抑菌作用。

另外，由表2觀察對4種細菌的抑菌效果，可以得出6種防腐劑對4種細菌的抑菌作用大小為：雙乙酸鈉、乳酸>山梨酸鉀>果糖+賴氨酸MRPs>乳酸鈉>Nisin，果糖+賴氨酸MRPs的抑菌作用居中，對Trans·T1、Top10、BL21、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別達到(20.49±0.22)，(21.63±0.41)，(23.82±0.37)，(20.05±0.28) mm，可見對4種細菌的抑菌強度較為均勻，其中Nisin的抑菌效果最弱，可能是由于Nisin在中性條件下溶解度太小，僅達到49.0 mg/mL，從而在牛津杯試驗中形成的少量沉淀影響了它在培養基中的擴散。

2.2 MRPs與不同防腐劑對不同菌株的抑菌率差異

以抑菌率為抑菌活性指標，美拉德反應產物與不同種類的防腐劑在不同添加量下對9種供試菌株的抑菌率見圖1和圖2。

圖1 MRPs與不同防腐劑對不同真菌的抑菌率Fig.1 The inhibition rates of MRPs and different preservatives on different fungi

圖2 MRPs與不同防腐劑對不同細菌的抑菌率Fig.2 The inhibition rates of MRPs and different preservatives on different bacteria

由圖1可知，6種防腐劑對5種酵母菌的抑菌率大小為：山梨酸鉀>乳酸>雙乙酸鈉>葡萄糖+精氨酸MRPs>乳酸鈉>Nisin。其中山梨酸鉀對MQ3-21和釀酒酵母這2株菌的抑菌率都為100%；雙乙酸鈉和乳酸2種防腐劑對MQ3-23、MQ3-18、MQ1-23這3株菌的抑菌效果有差異但不明顯，抑菌率相差不超過6%；葡萄糖+精氨酸MRPs對5株菌的抑菌效果相差較大，對MQ1-23的抑菌率達到52%，對MQ3-21的抑菌率為32%，而對釀酒酵母的抑菌率只有17%，對MQ3-23、MQ3-18的抑菌率不足10%；而國標限量下的Nisin對5株菌均無抑制作用。

同時，由圖2可知，6種防腐劑對4種細菌的抑菌率大小為：乳酸>Nisin>雙乙酸鈉>果糖+賴氨酸MRPs>乳酸鈉>山梨酸鉀。乳酸對這4株細菌的抑菌率均達到100%；Nisin對各菌株的抑菌率僅次于乳酸；乳酸鈉對4株菌的抑菌率相差較大，它對BL21和枯草芽孢桿菌的抑菌率達到了80%和95%，而對Trans·T1、Top10的抑菌率不到2%；果糖+賴氨酸MRPs與雙乙酸鈉的抑菌效果相似，且它們的抑菌效果都優于山梨酸鉀。

2.3 最小抑菌濃度(MIC)法測定結果分析

按照1.3.2.3所述試驗方法及步驟，采用二倍連續稀釋法測定MRPs與5種防腐劑分別對9種常見腐敗菌的最小抑菌濃度(MIC)，結果見表3和表4。

表3 MRPs對供試菌的最小抑菌濃度Table 3 The minimal inhibitory concentration of MRPs to tested strains

注：“-”表示無供試菌生長；“+”表示有供試菌生長； 9號試管為陰性對照；10號試管為陽性對照。

表4 5種防腐劑對供試菌的最小抑菌濃度Table 4 The minimal inhibitory concentration of five preservatives on tested bacteria mg/mL

注：“-”表示防腐劑最終質量濃度達到50 mg/mL 時仍不能完全抑菌。

由表3和表4可知，MIC值越低，即相應食品防腐劑的抑菌作用越強。Nisin對革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌有很強的抑菌作用，在5種防腐劑中，它的最小抑菌濃度與雙乙酸鈉相同，都是最小的，但是對于革蘭氏陰性的3種大腸桿菌，它的抑菌效果卻不明顯；且對以上5種酵母菌皆無抑菌作用，這與呂淑霞等[28]的研究結果一致。乳酸對革蘭氏陽性菌的最小抑菌質量濃度雖然比Nisin和山梨酸鉀略大，但遠優于乳酸鈉，尤其是對3種革蘭氏陰性菌Top10、BL21和Trans·T1的最低抑菌質量濃度是最小的。山梨酸鉀對5株酵母菌的最小抑菌質量濃度明顯低于其他防腐劑，而它對4株細菌的抑菌效果一般，分析其原因可能有以下幾個方面：山梨酸鉀對霉菌、酵母和好氣性菌均有抑制作用，但對嫌氣性芽孢形成菌與嗜酸乳桿菌則幾乎無效[29]，即山梨酸鉀并不是廣譜的防腐劑；對比可以看出雙乙酸鈉的抑菌廣譜性較好，而乳酸鈉對細菌的抑菌效果在5種防腐劑中最差。

各防腐劑的最低抑菌質量濃度綜合排序：對于細菌，乳酸<雙乙酸鈉<山梨酸鉀

3 結論

本實驗用抑菌圈、抑菌率、最小抑菌濃度3個指標來檢測MRPs、山梨酸鉀、Nisin等7種食品防腐劑對食物中常見細菌和真菌的抑制效果，結果表明7種防腐劑對各種供試菌都有不同程度的抑菌效果，防腐劑質量濃度越高，其抑菌效果越好?？傮w來看，7種防腐劑對于真菌的抑菌作用強弱為：山梨酸鉀>乳酸>雙乙酸鈉>葡萄糖+精氨酸MRPs>乳酸鈉>Nisin；對細菌的抑菌作用強弱為：乳酸>雙乙酸鈉>山梨酸鉀>果糖+賴氨酸MRPs>Nisin>乳酸鈉。同一種防腐劑，特別是抑菌效果中等的防腐劑，不僅對不同種的細菌抑菌效果不同，而且對于同種不同株的細菌，其抑菌效果也不盡相同，甚至相差很大。因此，對于防腐劑的抑菌效果，不能單純以菌種來定論，應具體到所涉及的每一株菌。對于大多數供試菌而言，山梨酸鉀、雙乙酸鈉、乳酸的抑菌效果最好。而2種MRPs的抑菌作用雖略低于化學防腐劑，但是優于乳酸鈉和Nisin 2種天然防腐劑，且抑菌廣譜性也優于其余幾種防腐劑。隨著人們生活和消費水平的提高，人們對食品安全提出了更高的要求，食品防腐劑的開發與使用為了順應市場的變化，其產品也越來越趨向“綠色”和“天然”等方向轉變，本實驗也進一步證明了MRPs作為食品防腐劑比生物防腐劑更高效，比化學防腐劑更廣譜。因此，天然、安全的MRPs防腐劑將是未來食品防腐領域研究的重點。