青蒿鱉甲方對二甲基苯蔥誘導雌鼠卵巢癌的影響及作用機制*

曹俊紅， 姬 霞， 杜文霞， 孫 紅

(河南省中醫院, 河南中醫藥大學第二附屬醫院， 河南 鄭州 450002)

目前，卵巢惡性腫瘤發病率較高，居婦科惡性腫瘤第3位，占人類整體惡性腫瘤5%。卵巢癌隱匿性較強，早期難發現，確診時往往已處于中晚期，患者存活率僅為5%，嚴重威脅女性健康及生命安全[1]。隨著現代中醫的發展，選擇傳統中醫方治療各類腫瘤及探究其治療機制，已成為醫學研究的熱點之一。青蒿鱉甲方首記于清代吳鞠通所著的《溫病條辨》，由青蒿、鱉甲、地黃、知母和牡丹皮組成。研究證明[2]，青蒿可調節免疫效應，消炎抑菌；鱉甲抑制結締組織增生，上調架蛋白表達和免疫力，延長抗體抗炎效應；知母、牡丹皮和地黃可抗過敏、解熱和抗炎。青蒿鱉甲方可用于祛陰虛、除內熱，已被用于治療“癌熱”，效果顯著。本項工作通過在雌鼠卵巢進行原位埋二甲基苯蔥藥線去建立卵巢癌動物模型，采取不同劑量青蒿鱉甲方干預卵巢癌雌鼠，探討青蒿鱉甲方對雌鼠卵巢癌的治療效果，分析其作用機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

同批次健康SPF級未孕雌性SD大鼠100只，3月齡，平均體重(200±20) g，由河南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心提供，許可證號為SYXK(豫)2017-0001，本研究經醫院實驗中心動物倫理委員會批準。采取隨機數表法將所有大鼠分為5組，每組20只，分為模型(model)組、青蒿鱉甲方高劑量(high dose)組、中劑量(medium dose)組和低劑量(low dose)組及西藥(western medicine)組。

2 儀器與試劑

PCR擴增儀(上海寶予德公司)；MP-510電泳儀(Major Science)；倒置顯微鏡和冷凍自動切片機(Lecia)。BCA蛋白試劑盒(Invitrogen)；二甲基苯蔥(Sigma)；青蒿鱉甲湯(河南省中醫院中藥房，含青蒿，鱉甲，生地黃，知母，牡丹皮)；Bcl-2多克隆抗體、Bax多克隆抗體、AKT/p-AKT多克隆抗體、BTAK多克隆抗體和羊抗兔HRP標記Ⅱ抗(Santa Cruz)；免疫組織化學(SABC)試劑盒、Western blot裂解液和蛋白上樣緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)。

3 方法

3.1卵巢癌雌鼠造模及分組給藥 棉線浸入20%二甲基苯蔥+10%苯溶液后，靜置40～50 min，待苯揮發后，調整棉線內二甲基苯蔥含量至0.5 mg/cm獲取致癌藥線。雌鼠腹腔注射麻醉后仰臥固定，下腹正中消毒后，于恥骨向上縱切開腹腔1.3～1.5 cm，完整暴露雌鼠腹腔內卵巢，分別將1根二甲基苯蒽致癌線縫入兩側卵巢，縫合腹腔，大鼠麻醉復蘇后，繼續分籠清潔級飼養，并行腹腔注射抗菌素預防感染。造模10 d后，斷頸處死1只大鼠，卵巢上若出現0.4 cm×0.4 cm×0.4 cm腫瘤則代表造模成功。造模成功后，各組大鼠行灌胃給藥，模型組給予同體積生理鹽水，高劑量組給予青蒿鱉甲湯3 g·kg-1·d-1，中劑量組給予青蒿鱉甲湯1.5 g·kg-1·d-1，低劑量組給予青蒿鱉甲湯0.75 g·kg-1·d-1，西藥組給予美洛昔康4 mg·kg-1·d-1，連續給藥6周。

3.2卵巢腫瘤組織形態學觀察 各組雌鼠給藥6周后取20只，處死，開腹取單側卵巢(本研究隨機選取左側卵巢)，剝取瘤體稱重，計算抑瘤率。抑瘤率(%)=(模型組瘤體重量-給藥組瘤體重量)/模型組瘤體重量×100%。此外，取部分腫瘤組織，用4%甲醛固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(片厚約4 μm)，行常規HE染色，光鏡下觀察并攝片，剩余卵巢腫瘤組織-20 ℃冷凍備用。

3.3卵巢腫瘤組織Bcl-2和Bax免疫組化檢測 采用EnVision免疫組化二步法，對各組雌鼠卵巢腫瘤組織石蠟切片常規脫蠟、水化，25 ℃下阻斷切片內源性過氧化物酶，滴入枸櫞酸鹽45 ℃修復組織切片，分別滴入Bcl-2多克隆抗體(濃度1∶200)、Bax蛋白多克隆抗體(濃度1∶250)25 ℃下孵育1 h，滴入羊抗兔HRP標記II抗25 ℃下孵育30 min，DAB染色、蘇木晴復染、脫水，透明后封片，于光鏡下觀察計數Bcl-2和Bax陽性細胞率，陽性細胞率(%)=陽性細胞/視野內總細胞×100%，每個切片計數10個視野，計算平均值，以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照，陽性細胞標準：細胞核呈棕色或棕褐色。

3.4卵巢腫瘤組織AKT、p-AKT和BTAK蛋白Western blot法測定 取冷凍卵巢腫瘤組織解凍后，切取約3 g，剪碎、研磨、濾網過濾，3 200 r/min離心5 min，靜置30 min棄上清液，獲得下層細胞液置于含10%胎牛血清DMEM(高糖)培養液中，于37 ℃、5% CO2下培養4 d，PBS洗10 min，胰酶消化、重懸，1 100×g離心，棄上清液，倒入蒸餾水，滴入細胞裂解液，1 100×g離心10 min，取上清液，BCA法定量蛋白質，取30 μg蛋白上樣、電泳、PVDF膜轉印，加入AKT、p-AKT、BTAK和GAPDH I抗、羊抗兔HRP標記II抗，以GAPDH為內參照，測定灰度值，計算灰度系數比，實驗操作均根據實驗試劑盒說明書執行。

3.5卵巢腫瘤組織AKT和BTAK mRNA水平測定 取冷存卵巢腫瘤組織解凍后，參照方法3.4獲得細胞，按照TRIzol?Reagent試劑盒說明書操作提取總RNA，按反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，-20 ℃保存備用。用Bio-Rad MJ mini型熒光PCR儀(Bio-Rad)測定AKT和BTAK mRNA表達，所有引物由武漢塞維爾公司合成，引物序列如下：AKT的上游引物序列為5’-TTTATTGGCTACAAGGAACG-3’，下游引物序列為5’-AGTCTGAATGGCGGTGGT-3’，擴增長度213 bp；BTAK的上游引物序列為5’-GCTGGAGAGCTTAAAATTGCAG-3’，下游引物序列為5’-TTTTGTAGGTCTCTTGGTATGTG-3’，擴增長度243 bp；β-actin的上游引物序列為5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’，下游引物序列為5’- CTGTGCCGTTGAACTTGC-3’，擴增長度140 bp。RT-qPCR測定各目的mRNA表達最終采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

4 統計學處理

選擇SPSS 19.0軟件進行統計學處理，計量資料選擇均數±標準差(mean±SD)表示，多組計量資料分析選擇單因素方差，組間比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組雌鼠卵巢瘤重和抑瘤率

高劑量組、中劑量組和西藥組瘤重顯著小于模型組瘤重(P<0.05)；高劑量組瘤重顯著小于低劑量組瘤重(P<0.05)。各組雌鼠卵巢癌抑瘤率與青蒿鱉甲方呈現劑量依賴性上升(P<0.05)，見表1。

表1 各組雌鼠卵巢瘤重和抑瘤率

Table 1.Ovarian tumor weight and tumor inhibition rate of female rats in each groups (Mean±SD.n=20)

GroupOvarian tumor weight (g)Inhibition rate(%)Model8.32±1.92-High dose3.12±1.18**#46.34±4.42##Medium dose4.70±1.42*31.21±3.81#Low dose6.29±1.3820.62±3.14Western medicine4.72±1.44*29.72±3.72#

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05,##P<0.01vslow dose group.

2 各組雌鼠卵巢腫瘤組織形態學觀察

模型組大鼠卵巢腫瘤組織內存在大量橢圓形腫瘤細胞，細胞核呈現深藍色，胞質飽滿；高劑量組、中劑量組和西藥組腫瘤組織內腫瘤細胞出現萎縮、凋亡，腫瘤細胞數量減少，細胞間隙擴大，高劑量組腫瘤細胞最少，有片狀腫瘤壞死區；低劑量組腫瘤組織內凋亡細胞較少，仍存在相當數量腫瘤細胞，見圖1。

Figure 1.Histomorphological changes of ovarian tumors in female rats of each group (HE staining).

圖1 各組雌鼠卵巢腫瘤組織形態學變化

3 各組雌鼠卵巢腫瘤組織Bcl-2和Bax蛋白陽性細胞率

光鏡下，模型組卵巢腫瘤組織視野內存在大量Bcl-2陽性細胞和少量Bax陽性細胞，細胞核呈現棕色和黃色；高劑量組視野內腫瘤組織內Bcl-2陽性細胞明顯少于中劑量組、低劑量組和西藥組，Bax陽性細胞明顯多于中劑量組、低劑量組和西藥組，見圖2。統計陽性表達率得出，高劑量組Bcl-2陽性細胞率顯著低于中劑量組、西藥組、低劑量組和模型組(P<0.05)；高劑量組Bax陽性細胞率顯著高于中劑量組、西藥組、低劑量組和模型組(P<0.05)，西藥組和中劑量組的Bcl-2和Bax陽性細胞率比較差異無統計學意義(P>0.05)；西藥組和中劑量組的Bcl-2陽性細胞率低于低劑量組，Bax陽性細胞率高于低劑量組(P<0.05)，見表2。

4 各組雌鼠卵巢腫瘤細胞AKT、p-AKT和BTAK蛋白表達

高劑量組、中劑量組、低劑量組和西藥組雌鼠卵巢腫瘤細胞AKT、p-AKT和BTAK蛋白表達顯著低于模型組(P<0.05)；高劑量組AKT、p-AKT和BTAK蛋白表達顯著低于中劑量組、低劑量組和西藥組(P<0.05)；中劑量組和西藥組AKT、p-AKT和BTAK蛋白表達顯著低于低劑量組(P<0.05)，見圖3、表3。

表2 卵巢腫瘤組織Bcl-2和Bax蛋白陽性表達率

Table 2.Positive expression rates of Bcl-2 and Bax protein in ovarian tumors (Mean±SD.n=20)

GroupBcl-2 positive cell rate (%)Bax positive cell rate (%)Model62.39±6.1310.31±3.42High dose12.28±4.19**##51.72±4.29**##Medium dose29.62±4.96**#26.19±4.22**#Low dose46.75±5.89*19.75±3.57*Western medicine28.71±4.88**#25.60±4.17**#

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05,##P<0.01vslow dose group.

Figure 2.Immunohistochemical staining of Bcl-2 and Bax proteins in ovarian tumors of female rats in each group.

圖2 各組雌性鼠卵巢腫瘤組織中Bcl-2和Bax的免疫組化染色

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05,##P<0.01vslow dose group.

5 各組雌鼠卵巢腫瘤細胞AKT和BTAK的mRNA表達

結果顯示，高劑量組、中劑量組、低劑量組和西藥組雌鼠卵巢腫瘤細胞AKT和BTAK mRNA表達顯著低于模型組(P<0.05)；高劑量組AKT和BTAK mRNA表達顯著低于中劑量組、低劑量組和西藥組(P<0.05)；中劑量組和西藥組AKT和BTAK mRNA表達顯著低于低劑量組(P<0.05)，見表4。

Figure 3.The protein expression of AKT, p-AKT and BTAK in ovarian neoplasm cells of female rats in each group.

圖3 各組BTAK、AKT、p-AKT的Western blot圖片

表4 雌鼠卵巢腫瘤細胞AKT和BTAK mRNA表達

Table 4.The mRNA expression of AKT and BTAK in ovarian tumor cells of female rats (Mean±SD.n=20)

GroupAKT (%)BTAK (%)Model44.28±10.0855.62±9.85High dose11.55±7.85**##12.52±8.15**##Medium dose25.66±8.85**#24.85±9.05**#Low dose31.02±9.25*34.28±9.11*Western medicine27.35±9.08**#28.27±9.51**#

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05,##P<0.01vslow dose group.

討 論

卵巢癌發生、發展及治療機制多借助大鼠模型進行研究，存在多種雌鼠卵巢癌建模方式，其中包括二甲基苯蔥誘發卵巢癌變。研究表明[3]，二甲基苯蔥致雌鼠卵巢癌變過程漫長、多因素參與，其可使得卵巢組織癌變病理及腫瘤分子形成機制相似于人類卵巢腫瘤。本研究通過在雌鼠卵巢進行原位埋二甲基苯蔥藥線的方法，使得二甲基苯蔥從卵巢上皮細胞滲透或通過線傷進入卵巢組織細胞，直接引起細胞惡性轉變，生成致癌因子，同時已惡變的卵巢細胞還可釋放多肽因子，刺激細胞分裂，并誘導周圍正常細胞惡變。雌鼠卵巢經埋二甲基苯蔥藥線建模后，埋線處出現卵巢腫瘤，卵巢癌雌鼠腫瘤組織出現大量橢圓形惡化細胞，與查付瓊等[4]研究相符，反映出二甲基苯蔥對卵巢組織癌化毒性。

青蒿鱉甲方主要成分為青蒿和鱉甲，青蒿芳香質輕，透邪外達，鱉甲品情性善[5]，養陰入絡別邪，二者均可入卵巢“陰”，搜“癌”邪，引邪出表。藥理學研究證明[6]，青蒿可調節生物體免疫效應，消除炎癥反應，抑制感染菌增殖；鱉甲可抑制結締組織增生，增加機體內架蛋白表達和免疫力，促進抗體長時間抗炎效應。研究證實，青蒿鱉甲方能夠改善肺癌大鼠腫瘤低氧微環境，抑制腫瘤炎癥反應[7]，由此可推斷青蒿鱉甲方能夠在一定程度抑制或緩解二甲基苯蔥誘導產生的卵巢腫瘤生長。本研究結果顯示，卵巢癌雌鼠經青蒿鱉甲方灌胃后，腫瘤組織內腫瘤細胞出現萎縮、凋亡，各組雌鼠卵巢瘤抑瘤率與青蒿鱉甲方劑量呈正相關，說明青蒿鱉甲湯能明顯延緩雌鼠卵巢腫瘤細胞生成，促進腫瘤細胞凋亡，且干預效果與使用劑量存在聯系，這可能因為腫瘤具有“陰虛內熱”，中醫特征即“癌熱”，癌熱由腫瘤組織低氧、酸中毒、炎癥反應和免疫細胞活化等代謝應激反應產生，而青蒿鱉甲湯具有清邪伏火特征，可消除“癌熱”。

為進一步了解青蒿鱉甲湯抑制雌鼠卵巢腫瘤的作用機制，我們分別觀察了各組雌鼠卵巢腫瘤組織內Bcl-2陽性細胞和Bax陽性細胞分布情況。細胞凋亡受bcl-2和bax等基因調控，前者具有抗細胞凋亡作用，后者具有促細胞凋亡作用[8]。研究表明[9]，正常細胞周期呈現Bcl-2低表達和Bax高表達，Bcl-2蛋白與Bax蛋白動態平衡可以調節細胞正常凋亡。本研究對卵巢腫瘤細胞進行光鏡觀察可見，卵巢腫瘤組織視野內存在大量Bcl-2陽性細胞和少量Bax陽性細胞，細胞核呈現棕色和黃色，經青蒿鱉甲湯干預后，腫瘤組織內Bcl-2陽性細胞明顯減少，Bax陽性細胞明顯增多。統計學結果也顯示，青蒿鱉甲湯治療后卵巢癌腫瘤組織內Bcl-2陽性細胞率顯著低于模型組(P<0.05)，表明青蒿鱉甲湯能夠下調卵巢癌腫瘤細胞Bcl-2蛋白表達，上調Bax蛋白表達，這可能與青蒿鱉甲湯通過改善機體免疫功能，調控腫瘤細胞Bcl-2蛋白和Bax蛋白平衡，促進腫瘤細胞凋亡有關。

AKT是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一，可調節細胞增殖、活性及凋亡[10]，在磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT信號通路中處于核心地位，其可被直接磷酸化，激活成為轉錄因子p-AKT，磷酸化下游底物[11]，實現對腫瘤細胞生長、增殖、侵襲和轉移的調控，促進腫瘤血管生成，抑制腫瘤細胞凋亡。研究表明[12]，激活的AKT可通過磷酸化作用調控下游靶蛋白Bcl-2和Bax等誘發細胞增殖，促進細胞凋亡。本研究結果顯示，青蒿鱉甲湯治療后雌鼠卵巢腫瘤細胞AKT和p-AKT蛋白表達及AKT mRNA表達均顯著降低，說明青蒿鱉甲湯能夠降低卵巢腫瘤組織內AKT表達，下調蛋白Bcl-2表達，上調Bax蛋白表達，促進細胞凋亡。此外，本研究還顯示，青蒿鱉甲湯治療后雌鼠卵巢腫瘤細胞BTAK蛋白及mRNA表達顯著低于模型組，由于BTAK是一個Aurora激酶家族的重要成員，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分子組成為403個氨基酸殘基，可通過參與細胞有絲分裂，影響惡性腫瘤的形成[12]，由此提示青蒿鱉甲湯能夠降低卵巢腫瘤組織內BTAK蛋白mRNA表達，抑制卵巢腫瘤細胞有絲分裂進程，阻斷卵巢惡性腫瘤生長，實現抗腫瘤效果。

綜上所述，青蒿鱉甲方能抑制二甲基苯蔥誘導雌鼠卵巢癌腫瘤細胞增殖，使用劑量越高，抑癌效果越明顯，其抑癌機制可能為通過降低AKT表達調控卵巢腫瘤細胞Bcl-2及Bax蛋白平衡和降低BTAK蛋白抑制卵巢腫瘤細胞有絲分裂。