TLR4-TRPC6在LPS致16HBE細胞內NF-κB P65表達和核轉位的作用*

李業盛， 凌振威， 陳慶梓， 吳佑森， 葉綺婷， 溫啟銳， 戴永亮， 李建華， 周麗芬△

(1廣州醫科大學基礎學院基礎醫學研究中心， 廣東省高校蛋白質修飾與降解重點實驗室,2廣州醫科大學附屬第三醫院第三臨床學院， 廣東 廣州 511436)

呼吸道疾病(如慢性阻塞性肺病、支氣管哮喘和過敏性鼻炎等)的患病率及死亡率逐年上升[1]，嚴重影響了全世界億萬人的身體健康，這類呼吸道疾病的病理生理過程通常伴有氣道炎癥反應，但其發病機制目前尚未闡明。氣道上皮細胞是呼吸道的第一道生理屏障，其與吸入的各種刺激物(如病原體、污染物和變應原)直接接觸，可作為啟動和促發炎癥反應的始動環節[2]。經典瞬時受體電位通道蛋白6(transient receptor potential channel 6，TRPC6)是一種非選擇性鈣離子通道，其基因編碼的蛋白在人體腦、腎和肝等多個器官中均有表達，而在肺臟中的表達尤為豐富[3]。本課題組前期研究[4]發現，細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可通過其受體Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)以及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號通路誘導氣道上皮細胞16HBE內TRPC6的過表達及鈣動員，使細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signalregulated kinase，ERK1/2)、p38和核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)發生磷酸化，從而引發炎癥反應。NF-κB是由P65和P50組成的異源二聚體，其作為一種多功能核轉錄因子，能促進細胞因子、趨化因子和黏附分子等的轉錄和翻譯，在機體細胞的生長發育、免疫應答以及炎癥反應等方面發揮重要作用[5]。當抑制因子IκB與NF-κB二聚體相結合時，NF-κB以失活狀態存在于胞漿中；當受到外源刺激時，IκB經泛素化和蛋白酶途徑降解后與NF-κB二聚體發生解體，從而使NF-κB發生活化和核轉位發揮轉錄調節的作用。本文探討TLR4/TRPC6在LPS誘導16HBE細胞內NF-κB P65表達和核轉位的作用，以期了解氣道上皮細胞發生炎癥反應時LPS除了使NF-κB磷酸化，能否通過TLR4/TRPC6調控NF-κB的表達和核轉位，從而為氣道炎癥的發生機制補充新的內容。

材 料 和 方 法

1 細胞和主要試劑

氣道上皮細胞株16HBE購自廣州吉尼歐生物科技有限公司。胎牛血清和高糖DMEM培養液購自Gibco；TRIzol購自Invitrogen；RT-PCR試劑盒購自TaKaRa；LPS、CLI-095和Hyp9購自Sigma；抗TRPC6抗體和山羊抗兔 II 抗購自CST；抗NF-κB P65抗體購自Abcam；山羊抗兔免疫熒光II抗購自北京中杉金橋公司；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

2 主要方法

2.1細胞培養 16HBE細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養于25 mL培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，每天換液1次，待細胞于對數生長期時用于實驗。實驗前將含10%胎牛血清的培養基換成無血清培養基培養24 h，然后按參考文獻[4]方法加入CLI-095(5 μmol/L)、Hyp9(10 μmol/L)和LPS(1 mg/L)處理16HBE細胞。

2.2RT-PCR實驗 收集待測樣本，加1 mL TRIzol后常規方法分離純化各組細胞的總RNA，分光光度計測定總RNA的含量及濃度。按照RT-PCR試劑盒提供的方法，將2 μL RNA逆轉錄為cDNA，然后進行PCR擴增，總反應體積為20 μL，其中2 μL 10×Ex Taq緩沖液(Mg2+Plus)、0.1 μL TaKaRa Ex Taq酶(5×106U/L)、1.6 μL混合dNTP(2.5 mmol/L each)、0.8 μL上游引物(10 μmol/L)、0.8 μL下游引物(10 μmol/L)、2 μL cDNA模板(100 ng)和12.7 μL無RNA酶去離子水。PCR引物序列由英濰捷基(上海公司)合成，序列見表1。反應參數為: 95 ℃預變性5 min； 94 ℃變性15 s、58 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s(NF-κB P65進行30個循環，β-actin進行25個循環)；循環結束后72 ℃再延伸5 min。取PCR產物10 μL與上樣緩沖液2 μL混合，行2%瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像系統拍照后用ImageJ軟件分析各目的基因條帶灰度與β-actin條帶灰度的比值。

表1 RT-PCR引物序列

2.3Western blot實驗 細胞吸出培養液，用預冷PBS緩沖液沖洗3遍，加入4%細胞裂解液，提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，取適量總蛋白進行SDS-PAGE，將總蛋白用濕法轉膜轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入I 抗4 ℃封閉過夜，TBST緩沖液洗膜，加入II 抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜，ECL發光顯影，以目的蛋白與內參照GAPDH的吸光度之比作為其相對表達量。

3.4免疫細胞化學染色法 各組細胞用PBS沖洗3遍后，迅速用冰甲醇固定10 min，0.3% Triton X-100 室溫通透10 min，加入山羊血清室溫封閉30 min，然后用抗NF-κB P65抗體4 ℃封閉過夜；次日復溫30 min后用PBS 洗3遍后，加入II 抗37 ℃避光孵育2 h，DAPI染核，5%甘油封片鏡檢，采用免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡觀測NF-κB P65的熒光表達及亞細胞定位。

3 統計學處理

用SPSS 20.0統計軟件分析數據。全部計量資料采用均數±標準誤(mean±SEM)表示。多組間數據比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，運用最小顯著性差異法(LSD法)進行組間兩兩比較，并運用Bonferroni校正的t檢驗進行組間多重比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 LPS上調16HBE細胞NF-κB P65的表達和核轉位

16HBE細胞接種于6孔板內培養至50%～60%密度融合時將含10%胎牛血清的培養基換成無血清培養基，培養24 h，加入LPS(1 mg/L)分別刺激細胞0、0.5、2、6、12和24 h后，使用RT-PCR、Western blot和免疫細胞化學染色法分別檢測16HBE 細胞內NF-κB P65的mRNA和蛋白表達以及核轉位的情況。結果顯示與正常組相比，LPS作用于16HBE細胞6 h后，NF-κB P65的mRNA和蛋白表達開始顯著上調，持續到24 h(P<0.05)，見圖1A、1B；在LPS作用2 h時NF-κB P65開始出現核轉位，隨著時間的延長，核轉位越來越明顯，見圖1C。

Figure 1.The effects of LPS stimulation on NF-κB P65 expression and nuclear translocation in the 16HBE cells at different times. A:the mRNA expression of NF-κB P65 was detected by RT-PCR; B: the protein expression of NF-κB P65 was determined by Western blot; C: the nuclear translocation of NF-κB P65 was detected by immunocytochemical staining (×400). Mean±SEM.n=4.*P<0.05vs0 h group.

圖1 LPS刺激不同時點對16HBE細胞NF-κB P65表達與核轉位的影響

2 TLR4介導LPS誘導的16HBE細胞內NF-κB P65的表達上調和核轉位

16HBE細胞接種于6孔板內，待生長密度至50%～60%時將含10%胎牛血清的培養基換成無血清培養基培養24 h,后分成對照(control)組、LPS組和LPS+CLI-095組,CLI-095(5 μmol/L)預處理30 min后加入LPS(1 mg/L)處理16HBE細胞6 h，使用RT-PCR、Western blot和免疫細胞化學染色法分別檢測細胞內NF-κB P65 的mRNA和蛋白表達以及核轉位。結果顯示TLR4抑制劑CLI-095能明顯抑制LPS誘導的16HBE細胞內NF-κB P65的表達以及核轉位(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The effects of TLR4 inhibitor CLI-095 on LPS-induced NF-κB P65 expression and nuclear translocation in the 16HBE cells. A:the mRNA expression of NF-κB P65 was detected by RT-PCR; B:the protein expression of NF-κB P65 was determined by Western blot; C:the nuclear translocation of NF-κB P65 was detected by immunocytochemical staining(×400). Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

圖2 TLR4抑制劑CLI-095對LPS誘導16HBE細胞NF-κB P65表達以及核轉位的影響

3 TRPC6介導LPS誘導的16HBE細胞內NF-κB P65的表達上調和核轉位

16HBE細胞接種于6孔板內，待生長密度至50%～60% 融合時，將生長培養基換成無血清培養基培養24 h，后分成control組、LPS組、Hyp9組和LPS+Hyp9組。單獨或同時加入Hyp9(10 μmol/L)和LPS(1 mg/L)刺激16HBE細胞6 h，應用RT-PCR、Western blot和免疫細胞化學染色法分別檢測16HBE細胞內NF-κB P65的mRNA和蛋白表達以及核轉位情況。結果顯示與正常組相比，Hyp9組和LPS組的NF-κB P65表達均明顯增加并出現核轉位，且LPS+ Hyp9組比單獨的Hyp9組和LPS組NF-κB P65的表達增加(P<0.05),核轉位現象更為明顯，見圖3。

討 論

NF-κB在多種肺部疾病，如急性肺損傷、肺部感染、哮喘、慢性阻塞性肺疾病以及肺纖維化中發揮著至關重要的作用。Bureau等[6]發現，與一般炎癥不同的是，即使撤去致敏原，哮喘動物氣道細胞中的NF-κB仍持續活化，而一些公認的NF-κB激活物，如過敏原、臭氧和LPS等可使哮喘癥狀惡化；反之，如果阻斷NF-κB的活化可以減輕LPS誘導的大鼠氣道炎癥[7]。Hart等[8]利用凝膠電泳遷移率變動分析和免疫組化技術發現，輕度哮喘患者的支氣管活檢標本和痰液中NF-κB的活化程度較正常人高，且NF-κB表達在氣道上皮細胞和炎癥細胞上，這些研究提示，NF-κB是氣道炎癥相關疾病防治的潛在靶點。本課題組前期研究[4]發現，1 mg/L LPS作用16HBE細胞6 h后炎癥因子白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)和IL-8開始顯著增高，持續到24 h。在本實驗中，同樣采用1 mg/L LPS刺激16HBE細胞6 h，NF-κB表達和核轉位的變化規律與前期研究一致。TLR4是天然免疫系統識別病原微生物抗原的主要受體。本研究采用TLR4的抑制劑CLI-095處理16HBE細胞后，LPS誘導的NF-κB P65的表達以及核轉位顯著下降，進一步表明TLR4介導LPS誘導的16HBE細胞內NF-κB P65的表達上調和核轉位。

Figure 3.The effects of TRPC6 activator Hyp9 on LPS-induced NF-κB P65 expression and nuclear translocation in the 16HBE cells. A:the mRNA expression of NF-κB P65 was detected by RT-PCR; B:the protein expression of NF-κB P65 was determined by Western blot; C:the nuclear translocation of NF-κB P65 was detected by immunocytochemical staining(×400). Mean±SEM.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHyp9 group;&P<0.05vsLPS group.

圖3 TRPC6激動劑Hyp9對LPS誘導16HBE細胞NF-κB P65表達以及核轉位的影響

TRPC6參與調控動物體內細胞周期、細胞分化和細胞凋亡等一系列的生理和病理過程，其基因突變或過表達可導致胞內鈣離子信號通路異常從而引起多種病理生理改變[9]。最近研究發現[10-11]，當內皮細胞受到各種炎癥介質的刺激時能被TRPC6調控從而增加細胞膜通透性。還有研究發現，慢性阻塞性肺疾病和哮喘患者中TRPC6的mRNA表達較正常組上調[12-13]。另外，Sel等[14]用卵白蛋白急性致敏TRPC6基因敲除小鼠建立氣道炎癥模型，TRPC6敲除可以減弱小鼠的過敏性反應，且TRPC6介導的免疫功能主要定位在Th2淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、B淋巴細胞和肥大細胞。有趣的是，Damann等[15]也發現TRPC6敲除小鼠來源的中性粒細胞的遷移能力較正常組減弱。以上研究提示，TRPC6在氣道炎癥反應中起重要作用，然而其在氣道上皮細胞中的作用尚不明確。本課題組前期研究[4]發現，TRPC6可調控LPS誘導的16HBE細胞中炎癥因子IL-6和IL-8的分泌以及NF-κB P65的磷酸化水平。另外，研究還發現TLR4特異性抑制劑CLI-095可拮抗LPS誘導的TRPC6 mRNA和蛋白表達上調，表明TLR4是TRPC6的上游信號通路。Hyp9作為一種簡化的二乙酰間苯三酚衍生物可以選擇性激活TRPC6通道，引起鈣離子內流[4, 16]。本研究進一步使用TRPC6的激動劑Hyp9處理16HBE細胞后發現LPS誘導的NF-κB P65表達和核轉位明顯增加。以上研究表明，TLR4-TRPC6信號通路除了使NF-κB磷酸化，還能調控NF-κB P65表達和核轉位。

綜上所述，LPS通過TLR4-TRPC6信號通路調控氣道上皮細胞內NF-κB P65的表達和核轉位，不僅為TRPC6調控氣道上皮細胞炎癥反應的作用機制補充新的內容，也為氣道炎癥性呼吸道疾病的防治提供靶點。