質子感知受體OGR1介導酸化環境對內皮祖細胞活力和成管作用的影響*

徐 吉， 丁聲龍， 陳方毅， 張繼紅， 桂柯科， 熊 敏， 李 炳， 趙明東△

(復旦大學金山醫院 1骨科， 2中心實驗室， 上海 201508； 3復旦大學附屬中山醫院青浦分院， 上海 200032)

股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head，ANFH)的特征是微循環血供損傷后發生骨細胞死亡，由于局部微循環障礙，股骨頭缺血，導致局部微環境pH降低(酸化)[1]。研究證實， ANFH的發生發展是一個涉及多因素、多途徑和多階段的復雜過程，局部血管功能失調被認為是股骨頭發生缺血壞死的始動因素和中心環節，被稱為是“髖關節的冠心病”[2]，而血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在維持血管穩定及血管新生過程中起著關鍵作用。

在ANFH 的股骨頭血管修復及新生過程中，各種危險因素對EPCs的影響至關重要，越來越多的學者關注并對骨髓EPCs調控ANFH發生機制進行了深入研究[3]。由于各種骨內、外致病因素引起骨組織營養血流減少、骨內血管網受壓或流出靜脈阻塞，造成局部血供障礙，骨組織缺血，乳酸濃度升高，質子(H+)增加[4]，但是缺血缺氧性酸化如何調控EPCs在ANFH的作用途徑尚未清楚。

2003年，Ludwig等[5]在 Nature 雜志上首次報道了卵巢癌G蛋白偶聯受體1(ovarian cancer G-protein-coupled receptor 1，OGR1)為質子感知受體(proton-sensing receptor)。OGR1是細胞膜上感知酸性環境的受體之一，對H+敏感，并負責細胞內的信號轉導，進而調控胞內一些病理生理反應[6]。在一些組織酸化的病理條件下，如哮喘等炎癥性疾病的氣道組織中，pH降低可激活OGRl，引發氣道平滑肌細胞分泌炎癥因子和氣道黏液分泌增多等病理反應[7]。Saxena等[8]發現氣道平滑肌細胞表達OGR1并介導酸誘導的細胞Ca2+信號，敲除OGR1基因明顯抑制酸誘導的氣道平滑肌收縮，表明OGR1在哮喘氣道平滑肌收縮過程中發揮了重要的作用。以上學者的研究為防治由pH值降低(酸化)引起氣道阻力增加的非特異性哮喘等疾病提供了新思路。那么，EPCs是否表達OGR1，深入探討OGR1在EPCs的表達對防治血管損傷性疾病，如ANFH，有重要意義。本研究分析EPCs中OGR1的表達水平，并分析OGR1介導的酸化效應對EPCs的生長、遷移和成管作用的影響。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

健康雄性BALB/c小鼠，體重18～20 g，由復旦大學上海醫學院實驗動物中心提供，合格證編號為20170005011053。實驗室溫度控制在20～25 ℃，濕度在50%～60%，自由飲水。

2 主要試劑與儀器

DEPC、N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)和單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)(Sigma)；TRIzol(Invitrogen)；Reverse Transcription System逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒(Fermentas)；抗DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ抗體及II抗(Santa Cruz)；硝酸纖維素膜(Whatman)；EGM-2 Single Quots培養液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和0.25%胰蛋白酶(HyClone)；Matrigel基質膠(Thermo Scientific)；碘化丙錠(propidium iodide，PI)、結晶紫溶液和總蛋白提取試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；抗OGR1抗體(CST)；抗β-actin抗體及II抗(上海生工生物工程有限公司)。Hema18R冷凍離心機和壓縮機制冷式基因擴增儀均為珠海黑馬醫學儀器有限公司產品。

3 方法

3.1小鼠骨髓源性EPCs的分離與培養 根據已發表文獻[9]，簡述如下：每次取雄性BALB/c小鼠6只，麻醉后頸椎脫臼法迅速處死并置入75%乙醇中浸泡45 min。用注射器沖洗小鼠脛、股骨的骨髓腔，沖洗獲得的骨髓細胞懸液以2 500 r/min離心30 min，后可觀察到離心管內液體分為3層：底層為紅細胞層；中層可觀察到約2～3 mm厚的白膜層，此即為單個核細胞層；上層為血清層。將白膜層吸出，PBS洗滌2次，并以1 mL EGM-2 Single Quots培養液定容、混勻，制成母液。以每孔5×106個的細胞量接種于人纖維連接蛋白包被的6孔培養板中，并置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。

3.2免疫熒光法鑒定小鼠EPCs 取培養至第21天的EPCs，接種細胞于纖維連接蛋白包被的載玻片上。21 d后取出載玻片，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，山羊封閉血清30 min， 加入抗DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ抗體(1 ∶100)于4 ℃孵育過夜。次日，PBS漂洗3次，加入羊抗大鼠IgG-FITC(1 ∶200)及羊抗兔IgG-PE(1 ∶500)，常溫下孵育1 h。PBS漂洗2遍后，以10%緩沖甘油封片。于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ的表達情況。

3.3實驗分組 分別采用pH 7.4，7.0，6.8，6.4和6.2的培養基處理EPCs 24 h，后用Western blot和real-time PCR分析OGR1的蛋白和mRNA表達；并分析OGR1在酸性環境中對EPCs的活力、遷移和成管能力的影響，分為pH 7.4對照(control)組、pH 6.4組、pH 6.4+干擾序列對照(control small interfering RNA, control-siRNA)組和pH 6.4+OGR1-siRNA組，處理時間為24 h。

3.4RT-PCR和real-time PCR實驗 按試劑盒說明操作，用TRIzol 提取總RNA，無RNA酶活性的DNA 酶消化以降解基因組DNA，酚仿抽提純化，電泳檢測完整性，RNA濃度測試后置于-70 ℃冰箱保存。后各取2 μg 總RNA和Oligo (dT) 16 (10 pmol/L) 1 μL，用M-MLV 逆轉錄酶逆轉錄成cDNA，加入ASICs特異性引物，引物由上海生工生物公司合成，見表1。反應條件：94 ℃ 預變性5 min;94 ℃變性30 s, 58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，40個循環；72 ℃延伸10 min結束反應。結果以2-ΔΔCt法分析。對于RT-PCR實驗，取6 μL PCR產物與2 μL Loading Buffer 混合，進行瓊脂糖凝膠電泳并拍照。

表1 RT-PCR 引物序列

3.5Western blot實驗 收集細胞加入細胞裂解液，提取細胞的總蛋白樣品經Larry 法定量，取50 μg 蛋白上樣，行15 % 的SDS-PAGE(100 V，1.5 h)。待溴酚藍進入凝膠底部后，把蛋白質再印跡到硝酸纖維素膜上，分別用抗OGRI和β-actin抗體孵育過夜，后加入用堿性磷酸酶標記的相應 II 抗，顯色劑顯色，凝膠成像分析。

3.6OGR1-siNRA的轉染 OGR1-siRNA的設計參考文獻[1]，正義序列為5′-UAGAAAGCAAGCCAGGAAGAUGACC-3′，非特異性的非靶向control-siRNA作為對照。OGR1-siRNA和control-siRNA均由上海吉瑪公司合成。EPCs經胰酶消化重懸后計數，在6孔板中鋪板，每孔加入2×105個細胞，培養過夜。轉染使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)進行，具體轉染方法依據Invitrogen的操作手冊。轉染后48 h，根據實驗分組設計的處理方法進行干預。轉染后，提取細胞總蛋白行Western blot檢測分析轉染效果。

3.7CCK-8 實驗檢測細胞活力 在96孔板每孔鋪5 000個細胞，EPCs按照實驗分組進行處理24 h后，將培養基更換成100 μL新鮮的培養基，然后在每孔中加入10 μL的CCK-8試劑，在37 ℃培養箱中孵育2 h，最后在酶標儀上于450 nm波長處測量并讀取吸光度(A)值。

3.8流式細胞術分析細胞周期分布 EPCs按照實驗分組處理后，用胰蛋白酶消化各組細胞并重懸于70%乙醇中，將細胞在-20 ℃中培養過夜。然后將固定的細胞用預冷PBS洗滌2次，加入含40 mg/L的PI和200 mg/ mL 的RNase A的碘化丙啶染色液，避光在37 ℃中孵育30 min。DNA含量用流式細胞儀(FACSCalibur，BD Biosciences)和細胞周期分布由FlowJo 7.6.1(Tree Star Inc)測定。

3.9劃痕實驗 胰酶消化細胞，并將細胞均勻接種至6孔板。待細胞生長至90%融合度時，將培養液換成無FBS培養液，放入培養箱中培養1 h。每孔用200 μL槍頭比著直尺畫一“十”字形劃痕，盡量保證劃痕寬度一致。PBS漂洗3次，去除漂浮的細胞，并加入無FBS培養液。培養48 h后在顯微鏡下于固定位置取樣并拍照。使用ImageJ軟件測量細胞遷移距離。

3.10Transwell遷移實驗 遷移實驗使用未鋪Matrigel膠的8 μm Transwell小室。Transwell小室下室中加入600 μL含1% FBS的DMEM培養液，胰酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min后去上清，DMEM完全培養液重懸細胞。細胞計數后，調整細胞濃度后，在Transwell小室上室加入100 μL細胞懸液，遷移實驗中，每個小室加入的細胞數為3×104個。將Transwell小室放入培養箱中培養24 h后，棄去培養液，上室放入4%多聚甲醛中，室溫固定15 min。吸干固定液，將上室放入0.1%的結晶紫溶液中，室溫染色15 min。顯微鏡下取3個隨機高倍視野計數細胞，使用ImageJ軟件統計結果。

3.11成管實驗 按照試劑盒說明書配制ECMatrix膠，將配好的ECMartrix膠添加到在4 ℃預冷的96孔板中，每孔50 μL，4 ℃，1 000 r/min離心10 min，使其平鋪于板底，并去除氣泡，后在37 ℃培養箱中孵育超過1 h，放至ECMartrix膠完全凝固。使用EPCs的細胞懸液(方法同上)，細胞濃度調整為(2.5～5)×107/L，每孔加入200 μL[每孔約(5～10)×103個細胞]，根據不同實驗組添加不同pH的培養液，在細胞培養箱(37 ℃、5% CO2)內培養，6 h后在相差顯微鏡下拍照，觀察管腔形成情況。

4 統計學方法

應用SPSS 18.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，如方差分析的結果具有統計學意義，再使用SNK-q方法進行各組均數間的兩兩比較。以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 內皮祖細胞的形態觀察及鑒定

原代培養的骨髓源性EPCs呈圓形，形態飽滿，折光性好；培養2 d后的內皮祖細胞開始貼壁，形態變為短梭狀；3 d 后開始增殖，體積增大。用DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙熒光染色法鑒定分化中的內皮祖細胞，在激光共聚焦顯微鏡下，DiI標記的ac-LDL為紅色熒光，而FITC標記的UEA-Ⅰ為綠色熒光，紅、綠熒光雙染的細胞即為EPCs，見圖1。

Figure 1.The EPCs were stained with DiI-Ac-LDL and FITC-UEA-Ⅰ.

圖1 EPCs攝取DiI-Ac-LDL和結合FITC-UEA-Ⅰ的雙熒光染色鑒定

2 OGR1在EPCs的表達

提取EPCs總RNA后逆轉錄成cDNA，用RT-PCR檢測，以肝作為陽性對照，發現EPCs中質子感知受體OGR1、G2A、GPR4和TDAG8的mRNA均有表達，其中OGR1和TDAG8表達最高，見圖2A。而采用real-time PCR并以OGR1為對照組后分析發現，EPCs中G2A和GPR4的mRNA含量明顯低于OGR1(P<0.05)，見圖2B。為進一步證實OGR1在EPCs的表達，根據real-time PCR結果，分別提取EPCs的總蛋白，采用Western blot的方法檢測OGR1的蛋白表達，結果表明EPCs中有OGR1的蛋白表達，見圖2C。免疫熒光細胞化學雙標記實驗結果可以看出，FITC配體熒光檢測可見EPCs細胞膜有明顯藍色免疫熒光，OGR1在細胞膜中有表達，見圖2D。

3 酸性環境促進OGR1在EPCs上的高表達

為分析酸性環境對EPCs上OGR1表達的影響，用不同pH的培養基處理EPCs 24 h，Western blot分析OGR1的表達是否隨著pH值而改變，結果發現細胞外環境的pH值從7.4到6.4逐漸下降過程中，OGR1表達逐漸升高，而pH達6.2時OGR1表達卻反而下降(P<0.05)，見圖3A。Real-time PCR結果與Western blot的結果相似，pH 6.4處理后EPCs中OGR1的表達比對照組明顯升高，而pH 6.2處理后EPCs中OGR1的表達比pH 6.4處理后更低(P<0.05)，見圖3B，說明酸性環境可以明顯促進OGR1的表達，因此后續研究使用pH 6.4的培養基作為處理EPCs的酸性環境。

4 OGR1介導酸對EPCs細胞活力的抑制作用

RNAi方法敲減OGR1的表達，進一步分析OGR1在EPCs中的作用。Western blot發現與轉染control-siRNA的細胞相比，轉染OGR1-siRNA 48 h后細胞中的OGR1表達明顯下降(P<0.05)，見圖4A。CCK-8實驗結果顯示，pH 6.4的培養基明顯抑制EPCs的細胞活力，但是敲減OGR1表達后卻可以明顯逆轉酸性環境對EPCs的作用，證實OGR1可能介導了酸對EPCs細胞活力的抑制作用(P<0.05)，見圖4B。流式細胞術分析細胞周期分布發現，與對照組相比，在pH 6.4的培養基中，處于G0/G1期細胞的百分率明顯升高，而S+G2/M期細胞的百分率卻明顯下降，說明酸性環境可以導致EPCs的生長停滯;然而敲減OGR1表達后G0/G1期細胞的百分率下降,而S+G2/M期細胞的百分率上升(P<0.05),見圖4C，因此OGR可能介導酸對EPCs生長周期的作用。

Figure 2.The expression of OGR1 in the EPCs. A: RT-PCR was used to detect the mRNA expression of proton-sensing receptor. The liver tissue was used as positive control; B:the mRNA expression of proton-sensing receptor expression was detected by real-time PCR; C: Western blot was used to determine the protein expression of OGR1; D: immunofluorescence staining was used to detect the OGR1 expression in the EPCs. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsOGR1 group.

圖2 OGR1在EPCs的表達

Figure 3.The effect of acid medium on the expression of OGR1 in the EPCs. A: the results of Western blot for determining the protein expression of OGR1 in the EPCs; B: the result of real-time PCR for detecting the mRNA expression of OGR1. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs7.4 group;#P<0.05vspH 6.4 group.

圖3 酸性環境培養基對EPCs中OGR1表達的影響

5 OGR1介導酸性環境對EPCs的遷移和成管能力的抑制作用

最后通過劃痕實驗、Transwell遷移實驗以及成管實驗分析酸性環境對EPCs的遷移和成管能力以及OGR1在其中的作用。劃痕實驗發現pH 6.4的培養基明顯抑制EPCs的遷移，但是敲減OGR1的表達后可以部分逆轉上述作用(P<0.05)，見圖5A，這說明OGR1可能介導了酸性環境對EPCs遷移的抑制作用；Transwell遷移實驗結果與劃痕實驗的結果相似，進一步證實了OGR1在酸性環境抑制EPCs遷移中的作用，見圖5B；成管實驗發現酸性環境明顯抑制EPCs的成管能力，但是敲減OGR1表達后EPCs的成管能力明顯增強(P<0.05)，見圖5C，這說明OGR1可能介導了酸性環境對EPCs成管能力的抑制作用。

Figure 4.The involvement of OGR1 expression in the inhibitory effects of acidic environment on the viability and the cell cycle distribution of EPCs. A:the results of Western blot for determining the protein level of OGR1 in the EPCs after transfection; B:the result of CCK-8 assay for detecting the cell viability; C:the quantification of cell cycle distribution was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=6.△P<0.05vscontrol-siRNA group;*P<0.05vspH 7.4 group;#P<0.05vspH 6.4+control-siRNA group.

圖4 OGR1介導酸性環境對EPCs活力和周期分布的影響

討 論

局部微循環的受損和功能失調被認為是ANFH的始動因素，而血管的自我修復往往對最終的骨壞死和骨塌具有重要作用[10]。骨修復的有效性依賴于血管損傷的程度和側枝血管的建立。因此，既往對于ANFH的研究主要著眼于血管內皮細胞的改變[11]，但是近來的研究發現骨髓源性EPCs相較于成熟的內皮細胞更多地參與血管化的過程以及血管的修復[12]。

EPCs主要來源于骨髓，是一種能直接分化為血管內皮的前體細胞，具有促進新生血管形成及提高微血管密度、促進內皮再生和提高血管通暢率等作用；其不僅參與胚胎期的血管發育，也在成體血管新生及維持血管穩定中起著重要的作用。此外，有研究發現富含EPCs的細胞系也能向成骨定向分化[13]。而且，越來越多的研究聚焦于骨骼損傷和骨修復中，提升EPCs水平能有助于血管新生，并利于新骨的形成，且在骨骼損傷或骨骼牽引術中，均可動員骨髓的EPCs釋放到血液循環，并促進血管新生，從而達到骨修復和骨愈合[14]。EPCs作為骨再生修復醫學的熱點很大程度上取決于骨骼發育的細胞水平，血管新生與新生骨互相促進。最近的研究發現股骨頭缺血性壞死患者的循環EPCs數目和功能都顯著降低[4, 10]，這些都強烈提示EPCs功能失調可能是股骨頭缺血性壞死發病機制的始動因素和中心環節及治療的關鍵靶點。本課題使用DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-l雙熒光染色法成功鑒定了內皮祖細胞，為后續的實驗奠定基礎。

已證實質子感知受體OGR1在哮喘等炎癥性疾病中發揮重要作用，而缺血性壞死與炎癥酸化具有相似病理基礎，那么EPCs中是否有OGR1的表達？本研究中利用RT-PCR技術發現OGR1在EPCs中mRNA的表達，進一步用Western blot也證實OGR1蛋白的存在。OGR1在EPCs中的研究有助于我們對疾病的認識，尤其是病變組織酸化常常與病理變化呈現一定程度的相關性。

Figure 5.The involvement of OGR1 expression in the inhibitory effect of acidic environment on the migration and tube formation ability of EPCs. A: scratch wound-healing assay was conducted in the EPCs with indicated treatment;B:Transwell migration assay was conducted in the EPCs with indicated treatment; C:the representative results of tube structure formation in cultured EPCs.Mean±SD.n=6.*P<0.05vspH 7.4 group,#P<0.05vspH 6.4+ control-siRNA group.

圖5 OGR1介導酸性環境對EPCs的遷移和成管能力的抑制作用

各種因素引起的股骨頭血供少、血管網受壓或流出靜脈阻塞引起的局部血供障礙，導致股骨頭乳酸濃度升高，質子增加從而成為酸性微環境[4]，但是酸化的環境對EPCs的作用以及其中的具體機制仍然未知。OGR1是一種酸環境的感知受體，屬于質子感知受體的一員。最近發現的質子感知受體包括OGR1，G蛋白偶聯受體G2A(G2 accumulation)，T 細胞死亡相關基因8(T cell death-associated gene 8，TDAG8)和G 蛋白偶聯受體4(G-protein-coupled receptor 4，GPR4)[15]，這些受體均是卵巢癌G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptors，GPCR)亞家族成員，GPCR介導細胞內多種信號通路的傳遞作用，并參與一些病理生理過程[16]。

GPCR亞家族在體內分布廣泛，其中OGR1因在破骨細胞表達且介導細胞內Ca2+的釋放被關注[16]。細胞外酸性環境能誘導終板軟骨細胞和破骨細胞Ca2+的水平迅速升高。用OGR1 的拮抗劑處理細胞，或用siRNA 抑制OGR1表達時，此效應被減弱，這證實OGR1可能介導了酸性環境對細胞作用，負責細胞內的一系列信號轉導并調控細胞功能[17]。本實驗通過Western blot及real-time PCR首次證實酸性環境誘導EPCs上的OGR1高表達，并且pH 6.4的培養基中OGR1表達最高，并以此作為下一步實驗的基礎。

不同的微環境對EPCs的增殖和成管能力可以產生不同的影響。Kim等[18]發現低氧微環境可以促進人EPCs增殖、遷移和成管能力，并且線粒體分裂及相關的信號通路參與其中。但是Wu等[19]發現在高糖和低氧的微環境卻可以抑制大鼠骨髓源性EPCs增殖、遷移和成管能力，并促進EPC的凋亡。而本課題通過Transwell、劃痕實驗和成管實驗等證實pH 6.4的酸環境抑制EPCs的活力、遷移和成管能力。更重要的是，我們通過siRNA沉默OGR1后證實OGR1可能介導了酸性環境對EPCs的作用，但是具體的OGR1下游的信號機制上需要進一步研究。

結合上述實驗結果，我們發現酸性環境促進小鼠骨髓來源EPCs高表達OGR1，然而酸性環境卻抑制EPCs生長、遷移和成管能力，敲減OGR1的表達可逆轉酸性環境對EPCs的作用，因此OGR1可能介導了酸性環境對EPCs生物學功能的抑制作用。OGR1在EPCs表達及作用有望為ANFH防治研究開辟新的突破點。