細葉遠志皂苷在Aβ23-35誘導SH-SY5Y細胞氧化損傷中的作用及機制研究

王 琳，金桂芳，余河漢，李 巧，楊 紅

廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣州 510006

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以認知和記憶損害為特征的神經退行性疾病，以細胞外β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)在腦內異常沉積為主要病理特征[1]。Aβ在腦內沉積會引起ROS過量產生，造成脂質、蛋白質和核酸等生物大分子過氧化，從而引起細胞和機體損傷，最終導致神經系統損傷[2,3]。在AD研究中，常使用Aβ片段如Aβ25-35及Aβ1-42在細胞上造AD模型進行體外研究，該類模型具有與AD患者相似的生物學特性，如原纖維形成，誘導自由基生成，神經毒性等[4]。自噬起到消除異常聚集蛋白和受損細胞器的關鍵作用，對維持細胞內穩態非常重要[5]。自噬功能會隨著年齡增長而減退，導致細胞內毒性蛋白的異常聚集，從而增加AD發生的風險[6]。研究發現，自噬誘導劑能通過激活自噬，減少線粒體ROS 釋放，減輕Aβ1-42誘導的PC-12細胞損傷，而自噬抑制劑會加劇Aβ1-42引起的細胞損傷[7,8]。

中藥遠志具有安神益智的功效，常用于心腎不交導致的失眠多夢、健忘驚悸，神志恍惚等癥。細葉遠志皂苷是遠志的主要活性成分，能夠顯著抑制Aβ25-35引起的PC12細胞凋亡和小鼠認知功能障礙，并顯著改善海馬注射Aβ25-35后小鼠的認知缺陷[9]。TEN化學性質穩定，且其在腦脊液中的消除半衰期長[10]，這些發現提示了TEN在臨床上防治AD的潛力。最近研究發現，遠志可通過誘導自噬減少Aβ的分泌起神經保護作用[11]。因此，本研究討論TEN通過調控細胞自噬，減少人神經母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y)細胞Aβ25-35誘導的氧化反應，并探討TEN抑制Aβ25-35毒性的作用和機制，為TEN防治AD提供基礎研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料

TEN購自成都普菲德生物技術有限公司，純度為99.8%；Aβ25-35購自美國Sigma公司；MTT購自廣州翔博生物科技有限公司；3-MA購自美國Selleck Chemicals公司；ROS、SOD、過氧化氫酶檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；MDA、GSH-Px檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；引物由華大基因設計；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)購自日本TaKaRa公司；Rabbit anti-β-actin、Goat anti-Rabbit二抗購自北京博奧森生物技術有限公司；Rabbit anti-Beclin-1、Rabbit anti-LC3、Rabbit anti-mTOR、Rabbit anti-AMPK、Rabbit anti-ULK1(Abcam公司)。

1.2 SH-SY5Y細胞培養

SH-SY5Y細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM完全培養基中，于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。當細胞密度達到70%～80%時，可進行細胞傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 MTT檢測細胞活力

SH-SY5Y細胞生長至對數期，以5×103個/孔隨機接種于96孔板中，每組5個復孔。分組如下：Control;Aβ25-35(20 μmol/L);TEN(50 μmol/L);3-MA(10 mmol/L);Aβ25-35(20 μmol/L)+ TEN(50 μmol/L);3-MA(10 mmol/L)+ Aβ25-35(20 μmol/L);3-MA(10 mmol/L)+ TEN(50 μmol/L)+ Aβ25-35(20 μmol/L)。先加入TEN或3-MA預處理2 h，再加入Aβ25-35共同處理24 h。每孔加入5 mg/mL 的MTT試劑10 μL，37 ℃孵育4 h后避光吸棄孔內液體，每孔加入DMSO 150 μL，于搖床上低速震搖10 min，充分溶解結晶，用酶標儀在490nm波長處測定A值。實驗重復3次，細胞存活率%=(A實驗組-A調零組)/(A對照組-A調零組)×100%。

1.4 觀察細胞形態

取對數生長期的SH-SY5Y細胞，以3×104個/孔接種于6孔板中。分組如1.3。37 ℃孵育24 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

1.5 DCFH-DA 熒光探針檢測ROS水平

SH-SY5Y細胞生長至對數期,以3×104個/孔接種于6孔板中。分組如下：Control;Aβ25-35(20 μmol/L);Aβ25-35(20 μmol/L)+ TEN (50 μmol/L);3-MA(10 mmol/L)+ TEN (50 μmol/L) + Aβ25-35(20 μmol/L)。先加入TEN和3-MA預處理2 h，再加入Aβ25-35共同處理24 h。收集細胞，將細胞重懸吸至1.5 mL EP管中，每管加入10 μM的DCFH-DA 200 μL，37 ℃孵育30 min。每隔3～5min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用DMEM培養基洗滌細胞3次，充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。使用熒光酶標儀對各組細胞熒光值進行檢測。實驗重復3次。

1.6 試劑盒檢測MDA、SOD、GSH-Px和過氧化氫酶(CAT)含量

按1.5培養細胞，收集細胞上清液及裂解液，按說明書進行操作，測定SH-SY5Y細胞內MDA、SOD、GSH-Px和過氧化氫酶含量，實驗重復3次。

1.7 RT-qPCR分析

按1.5培養細胞，用Trizol提取細胞總RNA，并用微量紫外/可見分光光度計測OD260/280值及RNA濃度。按照TaKaRa的PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒說明書進行逆轉錄反應。將得到的cDNA按TaKaRa的SYBR?Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)試劑盒說明書用CFX96Real-Time PCR Detection System進行熒光定量PCR反應。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 Western blot 分析

按1.5培養細胞，用含有PMSF的RIPA裂解液提取細胞總蛋白，以12 000 g、4 ℃離心5 min，BCA法測定蛋濃度。根據蛋白分子量，配制12%和6%的分離膠及5%的濃縮膠，設置80 V、30 min和120 V、60 min進行SDS-PAGE電泳，設置200 mA、90 min進行濕轉，5%脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。TBST洗膜后用ECL 顯色液激發化學發光，曝光，β-actin 作為內參。應用Image J 軟件對條帶進行灰度值比較。

1.9 統計學分析

用統計軟件SPSS 21.0進行分析，當P<0.05時有統計學意義。各組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩組間比較采用t檢驗，實驗數據以mean±SD的方式表示，所有實驗均重復3次。

2 結果

2.1 TEN對Aβ25-35誘導的細胞活力的影響

如Fig.1所示，MTT結果顯示，Aβ25-35組細胞活力顯著降低(P<0.01)，TEN組細胞活力基本無變化，3-MA組細胞活力下降，但與對照組比無顯著性差異，TEN+ Aβ25-35組細胞活力顯著高于Aβ25-35組，含有3-MA的實驗組細胞活力都顯著下降(P<0.05)。結果表明，TEN對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞活力損傷具有保護作用，其作用可被3-MA抑制。

2.2 TEN對Aβ25-35誘導的細胞形態的影響

如Fig.2 所示，Control組細胞密度大，貼壁能力強，生長狀態好(圖2A)，Aβ25-35組細胞數量明顯減少，貼壁性變差，折光性減弱，形態變差(圖2B)。TEN組細胞生長狀態好(圖2C)，3-MA組細胞胞體出現明顯皺縮，胞體邊緣模糊(圖2D)，Aβ25-35+TEN組細胞折光性變強，細胞狀態良好(圖2E)，Aβ25-35+3-MA組細胞出現明顯聚集狀態，折光性變差(圖2F)，TEN+3-MA+Aβ25-35組，細胞數比TEN+Aβ25-35組少，但細胞生長狀態基本正常(圖2G)。結果表明，TEN能改善Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞形態損傷，其作用可被3-MA抑制。

圖1 Aβ25-35和TEN對SH-SY5Y細胞活力的影響Fig.1 The effects of Aβ25-35 and TEN on the viability of the SH-SY5Y cells注：與正常組相比，**P<0.01；與Aβ25-35組比較，## P < 0.01，#P< 0.05。Notes:**P<0.01 vs control;#P< 0.05 vs Aβ25-35 ;##P<0.01 vs Aβ25-35．

2.3 TEN對Aβ25-35誘導的氧化應激的影響

如Fig.3所示，Aβ25-35組SH-SY5Y細胞的ROS、MDA水平顯著增加(P<0.05，P<0.01)，而SOD、GSH-Px和過氧化氫酶的活性顯著降低(P<0.05，P<0.01)；與Aβ25-35組相比，TEN能顯著減少ROS、MDA的產生而增加GSH-Px和CAT酶的活性(P<0.05，P<0.01)，同時3-MA會拮抗TEN的作用。結果表明，TEN顯著提高Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激水平，其作用部分可被3-MA拮抗。

2.4 TEN對自噬標志蛋白Beclin-1和LC3表達水平的影響

如Fig.4A RT-PCR結果顯示，Aβ25-35顯著增加Beclin-1(P<0.01)和LC3(P<0.05)的mRNA水平，與Aβ25-35組相比，TEN進一步增加了Beclin-1和LC3 mRNA的表達(P<0.05)，而3-MA減少TEN誘導的Beclin-1和LC3 mRNA的表達。Fig.4BC Western blot結果顯示，Aβ25-35顯著增加了Beclin-1 蛋白表達水平(P<0.01)，但對LC3-II/I 蛋白表達水平影響沒有顯著性差異，與Aβ25-35組相比，TEN進一步增加了Beclin-1和LC3-II/I 蛋白表達水平(P<0.01)，而3-MA減少TEN誘導的Beclin-1和LC3-II/I 蛋白表達。以上結果表明Aβ25-35誘導增加SH-SY5Y細胞內自噬的發生，而TEN作用進一步增加自噬的發生。

圖2 Aβ25-35和TEN對SH-SY5Y細胞的形態學的影響(×200)Fig.2 Morphological changes of SH- SY5Y cells by Aβ25-35 and TEN treatment (×200)

圖3 TEN對Aβ25-35誘導的氧化應激的影響Fig.3 The effects of TEN on the oxidative stress induced by Aβ25-35注：與正常組相比，**P<0.01，*P<0.05；與Aβ25-35組比較，## P < 0.01，#P< 0.05。Notes:*P <0.05 vs control;**P <0.01 vs control;#P< 0.05 vs Aβ25-35;## P <0.01 vs Aβ25-35．

2.5 TEN對SH-SY5Y細胞中的mTOR、AMPK和ULK1表達水平的影響

如Fig 5.A RT-PCR結果顯示，Aβ25-35顯著增加了mTOR mRNA表達水平(P<0.01)，并顯著降低了AMPK和ULK1 mRNA水平(P<0.01)，與Aβ25-35組相比，TEN顯著降低了mTOR mRNA表達水平(P<0.01)，并顯著升高了AMPK和ULK1 mRNA水平(P<0.01)，而3-MA增加TEN誘導的mTOR和ULK1 mRNA的表達，減少TEN誘導的AMPK mRNA的表達。圖5.BC Western blot結果顯示，Aβ25-35顯著增加了mTOR蛋白表達水平(P<0.01)，并顯著降低了AMPK和ULK1蛋白表達水平(P<0.01)，與Aβ25-35組相比，TEN顯著降低了mTOR蛋白表達水平(P<0.01)，并顯著升高了AMPK和ULK1蛋白表達水平(P<0.01)，而3-MA增加TEN誘導的mTOR和ULK1 蛋白表達，減少TEN誘導的AMPK mRNA的蛋白表達。結果表明，TEN可能通過調控AMPK/mTOR/ULK1通路激活細胞自噬，起到神經保護作用。

3 結論

AD 是常見的神經退行性疾病，其病理特征主要包括腦內Aβ異常沉積，Tau蛋白過度磷酸化所致神經元纖維纏結，神經元死亡等[1]。Aβ25-35是Aβ的毒性片段，可導致神經元纖維形成，誘導自由基生成，產生神經毒性等[12]，廣泛用于AD動物模型和細胞模型的建立。遠志是中草藥中記載的藥用植物，長期用于治療記憶喪失和改善認知功能[13]。TEN是一種提取自遠志的活性成分，其極易進入大腦并顯著改善老年小鼠的記憶和學習能力[9,10]，此外，TEN被證明可以保護PC12細胞免受Aβ25-35誘導的細胞凋亡[9]。通過建立Aβ25-35誘導的細胞模型，我們發現TEN可以改善Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞形態變異和活力下降，而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)能拮抗TEN的作用。

圖4 TEN對Aβ25-35誘導的SY5Y細胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1表達的影響 RT-PCR(A)，Western blot(B)和定量分析(C)Fig.4 Effects of TEN on expression of LC3-Ⅱ and Beclin-1 in SY5Y cells induced by Aβ25-35 detected by RT-PCR(A),Western blot(B) and confocal microscope(C)注：與正常組相比，**P<0.01，*P<0.05；與Aβ25-35組比較，## P < 0.01，#P< 0.05。Notes:*P <0.05 vs control;**P <0.01 vs control;#P< 0.05 vs Aβ25-35;## P <0.01 vs Aβ25-35．

圖5 TEN對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞中mTOR，AMPK和ULK1表達的影響 RT-PCR(A)，Western blot(B)和定量分析(C)Fig.5 Effects of TEN co-treatment on expression of mTOR,AMPK and ULK1 in SY5Y cells induced by Aβ25-35detected by RT-PCR(A),Western blot(B)and confocal microscope(C)注：與正常組相比，**P<0.01，*P<0.05；與Aβ25-35組比較，## P < 0.01，#P< 0.05。Notes:*P <0.05 vs control;**P <0.01 vs control; #P< 0.05 vs Aβ25-35;## P <0.01 vs Aβ25-35．

氧化還原平衡是細胞生存的必要條件[14]。Aβ在腦內沉積能引起氧化應激，而氧化應激也能反過來促進Aβ在腦內的聚集，導致DNA受損、線粒體功能紊亂、膜穩定性降低和細胞凋亡等神經毒性，進一步加快AD發展[15]。Song Y 等[8]發現雷帕霉素通過上調自噬，增強PC12細胞對損傷線粒體的清除能力，繼而減少了H2O2誘導的ROS釋放，降低細胞死亡率。相反，3-MA下調自噬，抑制線粒體自噬過程，導致損傷線粒體在細胞中累積，并釋放大量ROS進入細胞質導致細胞死亡，提示激活自噬能拮抗氧化應激損傷。張晶等[16]發現遠志皂苷元能減少H2O2模型鼠海馬神經元的MDA含量，升高SOD活性，從而提高海馬神經元的抗氧化能力。本研究結果表明，TEN能減輕Aβ25-35對SH-SY5Y細胞的氧化應激作用，其作用可被而3-MA逆轉。

細胞通過自噬-溶酶體降解機制，對異常蛋白質和受損細胞器進行分解，維持細胞內穩態，增強細胞的活力[17]。Beclin-1是調節自噬體起始物質組裝的分子平臺，其激活可以上調自噬。有研究表明，Beclin-1基因敲除的小鼠會因缺乏自噬活性而導致神經退行病變[18]。此外，當自噬發生時，LC3-I 會脂化為LC3-II定位于自噬體上，因此LC3-II/I常作為自噬的標志性蛋白來檢測自噬水平。研究發現，遠志能通過mTOR/AMPK通路加速異常蛋白的清除以及減少APP/BACE1細胞中Aβ的產生[19]。哺乳動物雷帕霉素靶酶(mammalian target of rapamycin,mTOR) 是一種蛋白激酶，是自噬的負調控因子，對維持神經細胞正常功能起重要作用。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate AMP-activated protein kinase,AMPK) 可在細胞內缺乏能量時被激活，被活化的AMPK 會抑制 mTOR，從而促進自噬體形成。ULK1是Atg1的同源物，激活mTOR能夠抑制ULK1活性而抑制自噬，而AMPK能誘導ULK1的磷酸化而激活自噬[19]。本研究結果顯示，TEN增加Aβ25-35誘導的細胞內Beclin-1和LC3-II/I水平，其激活細胞自噬的過程可能與mTOR/AMPK/ULK1信號通路有關。

總之，我們的研究結果表明TEN可通過調控mTOR/AMPK/ULK1通路增強細胞自噬，降低Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激損傷，增強細胞活力和改善細胞形態，發揮抑制毒性的神經保護作用。調節細胞自噬是治療AD的潛在策略之一，而TEN 可能是一種涉及到多機制的藥物，其調控細胞自噬機制還需進一步的研究。