寧前胡內生真菌Fusarium tricinctum次生代謝產物研究

劉叢彬，劉海濤，楊家欣，劉勁松，王 剛，王國凱*

1 安徽中醫藥大學藥學院 現代中藥安徽省工程技術中心，合肥 230012；2 中國醫藥大學附設醫院醫學研究部，臺中 40447

植物內生真菌是指那些在其成長過程中存在于植物組織內但并沒有引起植物組織明顯病變的真菌[1]。內生真菌次生代謝產物已經從中發現了許多具有抗菌，殺蟲，細胞毒和抗癌作用的活性成分[2]，且涵蓋了生物堿，萜類，醌類，肽類，氧雜蒽酮類和酚類[3]等多種結構類型，因此植物內生真菌次生代謝產物具有生物活性多樣、結構類型豐富等特點和優勢。

前胡為傘形科白花前胡(PeucedanumpraeruptorumDunn.)干燥根，常用于風熱感冒、咳嗽痰多、痰熱喘滿等癥狀[4]。寧國所產前胡具有個大、皮黑、肉白、條長、柔軟、香味濃等特點，為傳統道地藥材“寧前胡”[5]。目前沒有相關寧前胡內生真菌報道，前期研究從寧前胡中分離鑒定了41株內生真菌，分屬于10屬21種，其中Fusariumtricinctum為優勢菌株[6]。為探討寧前胡內生真菌次生代謝產物，從內生菌F.tricinctum液體發酵法的乙酸乙酯萃取物中分離鑒定了13個單體化合物，分別為cyclo-(L-pro-L-pro) (1)、cyclo-(S-pro-S-leu)(2)、cyclo-(L-phe-L-phe)(3)、cyclo-(D-pro-L-phe)(4)、cyclo-(L-pro-L-phe)(5)、cyclo-(D-pro-L-leu)(6)、cyclo-(S-pro-S-leu)(7)、cyclo-[D-(4-hydroxyprolinyl)]-(L)-leucine(8)、cyclo-[L-(4-hydroxyprolinyl)]-(L)-leucine(9)、cyclo-(trans-4-hydroxy-L-prolyl-L-phenylalanine)(10)、cyclo-(D-cis-hyp-L-phe)(11)、苯甲酸芐酯(12)和苯乙酸(13)。所有化合物均首次從內生真菌F.tricinctum中分離得到。體外抗腫瘤活性顯示化合物4、6、7對CAR、CAL27、SCC-4、SCC-9、HSC-3五種口腔癌腫瘤細胞有一定的細胞毒活性，可為寧前胡內生真菌次生代謝產物的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

質譜由Waters Auto Premier P776質譜儀測定；核磁共振由Bruker AM-400、DRX 500和AVANCE Ⅲ-600測定；制備液相為Agilent 1260；分析液相為Agilent 1100；中壓制備為BüCHI中壓制備；硅膠由青島海洋化工廠生產；Sephadex LH-20由GE公司生產。

1.2 菌種

新鮮寧前胡藥材采自安徽寧國，經安徽中醫藥大學梁益敏副教授鑒定為傘形科前胡屬白花前胡(P.praeruptorum)，憑證編號QHX34。F.tricinctum菌株從寧前胡新鮮根中分離得到，藥材及菌株保存于安徽中醫藥大學天然藥物化學研究室。

1.3 真菌發酵

F.tricinctum菌株接種到新PDA活化，6 mm打孔器打孔使菌塊均勻分布在液體培養基中。分裝、滅菌，接種后放入培養箱，135 rpm、28 ℃振蕩培養15 天。乙酸乙酯萃取發酵液，合并，得到浸膏13.6 g。

1.4 提取分離

發酵液乙酸乙酯萃取物浸膏經硅膠柱以氯仿-甲醇梯度洗脫，TLC檢測合并，得到6個組分。組分3經MPLC法以甲醇/水梯度洗脫，組分3-2經Sephadex LH-20(甲醇)和制備液相(乙腈/水,10∶90 → 25∶75)純化得化合物1(8.6 mg，20.5 min)和2(6.8 mg，23.3 min)。組分3-2以氯仿/甲醇經硅膠柱層析得到3個組份。組分3-2-2經Sephadex LH-20(甲醇)和制備液相(乙腈/水,20∶80 →35∶65)純化得化合物3(5.5 mg，27.7 min)。組分3-3經Sephadex LH-20 (甲醇)洗脫得到3個組分。組分3-3-1經制備液相(乙腈/水,30∶70 → 45∶55)制備得化合物4(3.5 mg，34.5 min)和5(4.5 mg，38.0 min)。3-3-2組分經制備液相(乙腈/水,25∶75 → 40∶60)制備得化合物6(5.0 mg，31.2 min)和7(3.0 mg，33.4 min)。組分4以氯仿/甲醇經硅膠柱層析得到4個組分，組分4-1經Sephadex LH-20(甲醇)和制備液相(乙腈/水,30∶70 → 45∶55)純化得化合物8(6.0 mg，26.5 min)和9(2.5 mg，27.4 min)。組分4-2以(甲醇/水,10∶100～100∶0)經MPLC梯度洗脫得到4個組分。組分4-2-1經Sephadex LH-20(甲醇)和制備液相(乙腈/水,20∶80 → 35∶65)純化得化合物10(5.3 mg，28.9 min)和11(2.0 mg，30.4 min)。組分5經Sephadex LH-20(甲醇)洗脫，組分5-1經制備液相(乙腈/水,10∶90 → 25∶65)制備得化合物12(11.3 mg，23.2 min)。5-2經制備液相(乙腈/水,15∶85 → 30∶70)制備得化合物13(6.3 mg，22.6 min)。

1.5 抗腫瘤活性篩選

采用MTT法[7]測定化合物對CAR、CAL27、SCC-4、SCC-9、HSC-3五種口腔癌腫瘤細胞株(中國醫藥大學附設醫院提供)的細胞毒活性。樣品梯度稀釋，腫瘤細胞分別接種于96孔板，每孔100 μL，加入不同濃度藥物，20 h每孔加入5 mg/mL的MTT 10 μL，繼續培養4 h后棄去上清液，加入100 μL DMSO，492 nm測定OD值。腫瘤細胞存活率是加藥組與對照組比較，公式：Viability (%) =(Atreatment/Acontrol)×100%，計算IC50。

2 結果

2.1 結構鑒定

化合物1白色晶體 (CH3OH)，ESI-MS:m/z217[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:4.36 (2H,t,J= 8.0 Hz,H-2,5),3.53 (2H,m,H-9,12),2.30 (2H,m,H-8,11),2.05 (2H,m,H-7,10);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:61.7 (C-2,5),168.6 (C-3,6),24.1 (C-7,10),28.7 (C-8,11),46.1 (C-9,12)。上述數據與文獻[8]報道基本一致，確定為cyclo-(L-pro-L-pro)。

化合物2白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z219[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:4.13 (1H,t,J= 8.2 Hz,H-6),4.05 (1H,s,H-9),3.63～3.69 (1H,m,H-3a),3.53-3.62 (1H,m,H-3b),2.68 (1H,m,H-4a),2.33-2.38 (1H,m,H-4b),1.88-2.06 (1H,m,H-10),1.09 (3H,d,J= 8.2 Hz,H-11),0.95 (3H,d,J= 8.2 Hz,H-12);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:172.8 (C-1),46.3 (C-3),25.7 (C-4),29.0 (C-5),60.2 (C-6),167.9 (C-7),54.6 (C-9),30.3 (C-10),19.6 (C-11),16.8 (C-12)。上述數據與文獻[9]報道基本一致，確定為cyclo-(S-pro-S-leu)。

化合物3白色晶體 (CH3OH)，ESI-MS:m/z317[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.30～7.02 (5H,m,H-2′,3′,4′,5′,6′),4.07 (1H,dd,J= 3.6,13.4 Hz,H-3),2.08 (2H,dd,J= 8.0,13.4 Hz,H-3a);13C NMR (150 MHz,CD3OD)δ:166.2 (C-2),55.4 (C-3),136.5 (C-1′),129.8 (C-2′),128.2 (C-3′),126.5 (C-4′),39.6 (C-3a)。上述數據與文獻[10]報道基本一致，確定為cyclo (L-phe-L-phe)

化合物4白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z267[M+Na]+；1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.29～7.18 (5H,m,H-2′,3′,4′,5′,6′),4.19 (1H,t,J= 6.8 Hz,H-9),4.05 (1H,m,H-6),3.53 (2H,m,H-3),3.33～3.28 (1H,dd,J= 4.0,9.4 Hz,H-10b),3.21～3.16 (1H,dd,J= 4.0,9.4 Hz,H-10a),3.00～2.85 (1H,dd,J= 4.8,13.9 Hz,H-6),2.63～2.59 (1H,m,H-5b),2.03-2.01 (1H,m,H-5b),1.90 (2H,m,H-4),1.68-1.57 (1H,m,H-5a);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:167.4 (C-1),46.1 (C-3),22.4 (C-4),29.8 (C-5),59.0 (C-6),171.3 (C-7),59.7 (C-9),40.9 (C-10),136.7 (C-1′),131.2 (C-2′),129.6 (C-3′),128.5 (C-4′)。上述數據與文獻[11]報道基本一致，確定為cyclo-(D-pro-L-phe)。

化合物5白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z267[M+Na]+；1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.27～7.22 (5H,m,H-2′,3′,4′,5′,6′),4.43 (1H,t,J= 1.9,5.0 Hz,H-9),4.05 (1H,m,H-6),3.54 (2H,m,H-3),3.36 (1H,m,H-10a),3.23～3.15 (1H,m,H-10b),2.08 (1H,m,H-5a),1.81～1.75 (2H,m,H-4),1.23～1.18 (1H,m,H-5b);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:167.5 (C-1),45.9 (C-3),22.7 (C-4),29.3 (C-5),57.6 (C-6),170.9 (C-7),60.0 (C-9),38.2 (C-10),137.3 (C-1′),131.2 (C-2′),129.4 (C-3′),128.0 (C-4′)。上述數據與文獻[11]報道基本一致，確定為cyclo-(L-pro-L-phe)。

化合物6白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z233[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:4.28 (1H,dd,J= 6.4,9.5 Hz,H-6),3.84 (1H,dd,J= 5.4,9.5 Hz,H-9),3.60 (1H,m,H-3a),3.57～3.46 (1H,m,H-3b),2.34 (1H,m,H-4a),2.02～1.88 (1H,m,H-4b),1.84 (2H,m,H-5),1.78 (1H,m,H-10a),1.67 (1H,m,H-10b),1.56 (1H,m,H-11),0.98 (3H,d,J= 6.4 Hz,H-12),0.95 (3H,d,J= 6.5 Hz,H-13);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:171.6 (C-1),46.7 (C-3),23.0 (C-4),29.9 (C-5),61.3 (C-6),169.0 (C-7),59.3 (C-9),43.6 (C-10),25.5 (C-11),23.3 (C-12),21.9 (C-13)。上述數據與文獻[9]報道基本一致，確定為cyclo-(D-pro-L-leu)。

化合物7白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z233[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:4.13 (1H,dd,J= 8.2 Hz,H-6),4.05 (1H,dd,J= 3.4,9.4 Hz,H-9),3.50 (2H,m,H-3),2.28 (1H,m,H-5a),2.03 (1H,m,H-5b),1.99 (2H,m,H-4a,H-10a),1.91 (2H,m,H-4b,H-10b),1.51 (1H,m,H-11),0.95 (6H,m,H-12,13);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:172.8 (C-1),46.3 (C-3),23.6 (C-4),29.0 (C-5),60.2 (C-6),168.9 (C-7),54.6 (C-9),39.3 (C-10),25.7 (C-11),23.3 (C-12),22.2 (C-13)。上述數據與文獻[12]報道基本一致，確定為cyclo-(S-pro-S-leu)。

化合物8白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z249[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:4.45 (1H,dd,J= 6.6,11.3 Hz,H-6),4.38 (1H,t,J= 4.2 Hz,H-8),4.15 (H,m,H-3),3.66 (1H,dd,J= 4.6,12.6Hz,H-9a),3.46 (1H,d,J= 12.4 Hz,H-9b),2.28 (1H,dd,J= 6.4,13.2Hz,H-7a),2.11 (1H,m,H-7b),1.99～1.78 (2H,m,H-10),1.65～1.36 (1H,m,H-11),0.96 (6H,m,H-12,13);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:171.2 (C-2),57.5 (C-3),169.4 (C-5),69.2 (C-6),37.6 (C-7),54.4 (C-8),56.9 (C-9),43.3 (C-10),25.5 (C-11),23.0 (C-12),21.9 (C-13)。上述數據與文獻[13]報道基本一致，確定為cyclo-[D-(4-hydroxyprolinyl)]-(L)-leucine。

化合物9白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z249[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:4.47 (1H,m,H-8),4.05 (1H,dd,J= 4.2,10.3 Hz,H-6),3.88 (2H,m,H-3,9a),3.56 (1H,dd,J= 4.6,12.4 Hz,H-9b),2.46 (1H,dd,J= 6.4,13.2Hz,H-7a),2.29 (1H,m,H-7b),1.99～1.78 (2H,m,H-10),1.65-1.36 (1H,m,H-11),1.03 (3H,d,J= 6.9 Hz,H-12),0.98 (3H,d,J= 6.9 Hz,H-13);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:172.3 (C-2),56.9 (C-3),169.8 (C-5),59.7 (C-6),37.7 (C-7),69.4 (C-8),55.4 (C-9),43.1 (C-10),25.2 (C-11),23.4 (C-12),21.5 (C-13)。上述數據與文獻[14]報道基本一致，確定為cyclo-[L-(4-hydroxyprolinyl)]-(L)-leucine。

化合物10白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z283[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.29～7.17 (5H,m,H-2′,3′,4′,5′,6′),4.32～4.30 (2H,m,H-9,H-8),4.20 (1H,t,J= 4.4 Hz,H-4),3.72 (1H,dd,J= 5.1,13.0 Hz,H-3b),3.21 (1H,d,J= 13.4 Hz,H-3a),3.02 (2H,dd,J= 3.3,5.2 Hz,H-10),1.99 (1H,dd,J= 6.0,13.0 Hz,H-5a),1.08 (1H,m,H-5b);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:171.3 (C-1),38.9 (C-3),67.9 (C-4),55.4 (C-5),167.5 (C-7),57.3 (C-8),59.7 (C-9),40.9 (C-10),136.5 (C-1′),131.1 (C-2′,6′),129.7 (C-3′,5′),128.5 (C-4′)。上述數據與文獻[15]報道基本一致，確定為cyclo-(trans-4-hydroxy-L-prolyl-L-phenylalanine)。

化合物11白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z283[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.27～7.18 (5H,m,H-12,13,14,15,16),4.32～4.24 (2H,m,H-3,8),3.72 (1H,dd,J= 5.1,13.0 Hz,H-9b),3.21 (1H,m,H-9a),3.02 (2H,dd,J= 4.8,13.3 Hz,H-10),2.78 (1H,t,J= 9.6 Hz,H-6),2.21 (1H,dd,J= 6.6,12.8 Hz,H-7a),1.94 (1H,m,H-7b);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:167.5 (C-2),59.7 (C-3),171.3 (C-5),57.1 (C-6),38.9 (C-7),67.9 (C-8),55.4 (C-9),40.9 (C-10),136.5 (C-11),131.1 (C-12,16),129.7 (C-13,15),128.5 (C-14)。上述數據與文獻[15]報道基本一致，確定為cyclo-(D-cis-hyp-L-phe)。

化合物12淡黃色油狀物 (CH3OH)，ES I-MS:m/z235[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.45～7.29 (5H,m,H-4,5,6,7,8,9),7.27～7.11 (5H,m,H-2′,3′,4′,5′,6′),3.30 (2H,s,H-3);13C NMR (100 MHz,CD3OD)δ:173.5 (C-1),63.2 (C-3),137.6 (C-4),123.6 (C-5,9),125.8 (C-6,8),124.0 (C-7),130.8 (C-1′),127.5 (C-2′,6′),125.2 (C-3′,5′),132.3 (C-4′)。上述數據與文獻[16]報道基本一致，確定為苯甲酸芐酯。

化合物13白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z136[M]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.31～7.22 (5H,m,H-2,3,4,5,6),3.58 (2H,s,H-7);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:136.2 (C-1),130.2 (C-2,2′),129.4 (C-3,3′),127.8 (C-4),42.1 (C-7),175.9 (C-8)。上述數據與文獻[17]報道基本一致，確定為苯乙酸。

2.2 抗腫瘤活性結果

化合物1～13進行了對5種口腔癌細胞株 CAR、CAL27、SCC-4、SCC-9、HSC-3抗腫瘤活性的細胞毒篩選，結果發現化合物4、6、7具有中等的抑制作用，結果見表1。以IC50表示半抑制濃度，其中化合物4對5種口腔癌細胞株IC50分別是45.33 ± 3.21、39.42 ± 2.19、40.23 ± 2.72、40.22 ± 3.21、39.44 ± 2.98 μM/mL?；衔?對5種口腔癌細胞株IC50分別是46.43 ± 3.98、41.23 ± 2.19、40.89 ± 2.98、43.22 ± 2.11、40.42 ± 2.96 μM/mL?；衔?對5種口腔癌細胞株IC50分別是48.98 ± 2.33、43.21 ± 1.12、41.23 ± 3.23、45.22 ± 2.23、42.42 ± 3.01 μM/mL。

3 結論

從道地藥材寧前胡內生菌F.tricinctum液體發酵液中分離并鑒定了13個單體化合物，所有化合物均首次從F.tricinctum內生真菌中分離得到。體外抗腫瘤活性顯示化合物4、6、7對CAR、CAL27、SCC-4、SCC-9、HSC-3五種口腔癌腫瘤細胞有一定的細胞毒活性。

表1 化合物抗腫瘤細胞毒活性