紫杉醇長循環納米膠束的制備及其對乳腺癌多藥耐藥的研究

許河南，王月月,2，陳天天，閆 雷，王文銳，楊清玲，陳昌杰

乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一。過去20 年中國女性乳腺癌發病率呈現持續增長的趨勢，預計到2030年，全球乳腺癌的發病人數和死亡人數將分別達到264萬和170萬[1-2]?；熢诮档腿橄侔┺D移率和死亡率方面發揮著至關重要的作用[3]。

紫杉醇(paclitaxel，PTX)是從紅豆杉屬植物提取的一種具有廣譜、高效抗癌活性的二萜類化合物，能夠有效抑制微管蛋白的解聚并保持其穩定，從而抑制癌細胞有絲分裂的進程，最終達到抑制腫瘤增殖的作用[4]。紫杉醇對乳腺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌等具有良好的治療作用，是治療復發和轉移性乳腺癌的臨床一線化療藥，但存在水溶性低，生物利用度較差，不良反應大等缺點[5]，同時，紫杉醇是P-糖蛋白(P-gp)底物，P-gp泵可將藥物轉運出細胞外從而導致腫瘤細胞耐藥性的產生，也是導致乳腺癌紫杉醇化療失敗的主要原因[6]。

納米載藥系統在有效進行藥物輸送、提高藥物靶向濃度、降低藥物對正常組織的毒性和克服化療藥物耐藥性等方面為化療藥物的發展提供了新的解決途徑[7]。PEG-DSPE是聚乙二醇的磷脂衍生物，為兩性高分子化合物，既含有親水的聚乙二醇又含有疏水的腦磷脂，在水中的性質近似于表面活性劑，以膠束的形式存在[8]。當PEG-DSPE與脂質體混合時，其疏水端插入脂質體雙分子膜，使PEG-DSPE親油的羧基嵌入脂質體形成穩定的聚乙二醇保護層，避免了網狀內皮系統對它的吞噬作用，延長了脂質體在血液中的循環時間[9]。

維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS) 在納米藥物系統的應用得到廣泛研究。美國 FDA 早已批準 TPGS 作為一種安全的藥用輔料，可廣泛應用于藥用處方中，在制劑中可作為增溶劑、吸收促進劑、乳化劑、增塑劑、致孔劑及固體分散體的載體等[10]。TPGS作為一種生物材料，具有良好的促進吸收作用和抗多重藥耐藥作用，增強細胞攝取和細胞毒性，具有良好的生物粘附性能，尤其是對ATP 結合盒 (ATP binding cattle，ABC) 轉運蛋白家族有較強的抑制作用[11]。TPGS 作為一種非離子表面活性劑，不僅能夠抑制ABC轉運蛋白家族中的P-gp 泵，其本身也是一種兩親性共聚物，具有較強的藥物乳化能力，因此可將其應用于納米混懸劑的輔助穩定劑[12]。

為了有效提高紫杉醇抗腫瘤效應，降低不良反應及提高逆轉腫瘤多藥耐藥作用，本研究擬選用PEG-DSPE作為納米載體，構建TPGS修飾的紫杉醇長循環膠束給藥系統，考察該給藥系統在體外的抗腫瘤效應及逆轉多藥耐藥作用，為開發新型的抗癌藥物給藥系統提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人乳腺癌細胞株MCF-7購自中國科學院細胞庫；胎牛血清購自 Hyclone 公司； DMEM 高糖培養基購自Hyclone公司； PEG2000-DSPE購買于艾韋特公司；紫杉醇粉劑購買于美侖生物公司；TPGS購買于阿拉丁生化公司；聚偏氟乙烯(PVDF膜)、ECL化學發光試劑盒購自美國Millipore公司；Transwell小室買于Corning公司；Annexin V & Dead Cell凋亡試劑盒購買于Muse公司。一抗Bcl-2、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、Caspase-3、β-actin、多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)、多藥耐藥基因1(multidrug resistance 1，MDR1)及其編碼產物P-gp購自Proteintech公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔、兔抗鼠二抗購自北京中山金橋有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 MCF-7紫杉醇耐藥細胞株(MCF-7/PR)由本實驗室構建保存，構建方案采用紫杉醇體外濃度梯度遞增聯合大劑量間斷沖擊方法誘導MCF-7細胞產生耐藥性，使其能在含有10 μmol/L濃度的紫杉醇培養液中穩定生長6個月以上以維持其耐藥性[13]。所有細胞在含10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培養基中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養，每3～4 d傳代1次。所有實驗均采用對數生長期細胞。

1.2.2 紫杉醇聚合物膠束的制備及表征 采用薄膜分散法制備紫杉醇球狀膠束，按處方稱取一定量的PTX、TPGS、DSPE-PEG2000(TPGS與DSPE-PEG2000 的摩爾比分別為1∶10，藥脂比為1∶20，w/w)，置于圓底燒瓶中。加入適量的甲醇，超聲并水浴使其充分溶解，將混合溶液在旋轉蒸發儀上溫度保持45 ℃左右，轉速100 r/min，進行旋轉蒸干。形成半透明薄膜后，隨即加入PBS 緩沖液對形成的脂膜進行水化，并在室溫下孵育12 h，10 000 r/min離心10 min去除未包載的紫杉醇，沉淀收集在凍干瓶中并在-80 ℃下保存8 h以備后續凍干，在-55 ℃下減壓下初步干冷凍干燥36 h獲得紫杉醇膠束凍干粉末。將納米顆粒溶液放置于400目碳包埋的銅網上，隨后通過透射電鏡檢測其納米顆粒的形態。將制備好的紫杉醇膠束凍干粉末，取適量稀釋后，室溫下放入粒徑分析檢測器中，檢測粒徑；同時另取稀釋好的紫杉醇膠束溶液置于電位杯中，對Zeta 電位進行測定。

1.2.3 磺酰羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)染色檢測細胞的增殖活性 對數生長期細胞消化后離心，制成單細胞懸液接種于96孔板，培養過夜使細胞貼壁生長。按對細胞進行加藥處理后繼續培養24 h終止培養，吸出培養基，每孔加入200 μL 10%三氯乙酸(TCA)，4 ℃固定50 min，用雙蒸水洗滌5次，室溫下干燥；每孔加入100 μL 0.4% SRB染液染色30 min，用1%乙酸溶液洗滌5次后干燥，每孔加入150 μL 10 mmol/L Trisbase溶液，搖床上劇烈振蕩15 min，待SRB染液充分溶解，酶標儀檢測波長515 nm處的吸光度值。存活率=(實驗組吸光度值-空白組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)。

1.2.4 Annexin V/PI染色檢測細胞凋亡 調整細胞懸液濃度后接種于6孔板中，每孔加入2 mL培養基，按照實驗分組進行加藥處理，24 h后0.25%不含EDTA胰酶消化離心，收集全部細胞，用4 ℃預冷的PBS洗滌細胞2次；按照凋亡試劑盒說明書進行操作，避光孵育30 min，流式細胞儀進行凋亡檢測。

1.2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 胰酶消化對數生長期細胞，制成單細胞懸液接種于6孔板，培養過夜細胞貼壁生長，當細胞密度達80%～90%時，10 μL無菌槍頭使用相同力度在細胞板中間輕輕劃出一道劃痕，注意保持各組劃出劃痕的寬度基本一致，用PBS沖洗3次，再對細胞進行相關的加藥處理，分別于加藥后0、24 h在低倍鏡下測量各組細胞任意3個部位的不同痕跡寬度。

1.2.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 胰酶消化對數生長期細胞，用無血清培養基將每組的細胞調整到相同細胞密度。按照實驗分組，每組各取100 μL 加入Transwell 小室的上室。Transwell 小室底部預先加入60 μL已稀釋的Matrigel基底膜基質膠，下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM 培養基，5%CO2、37 ℃培養箱中培養24 h。取出Transwell小室，用棉簽小心擦去Transwell小室上室的培養基以及膜上部未穿過的細胞，4%多聚甲醛固定20 min，吉姆薩染液染色，拍照觀察高倍鏡下穿過的細胞數目。

1.2.7 蛋白印跡法檢測蛋白表達 按對照組、紫杉醇組、紫杉醇膠束組處理細胞，消化細胞后用預冷PBS洗滌，每組加入80 μL蛋白裂解液充分混勻，冰上裂解30 min后4 ℃離心15 min吸取上清液；蛋白質二喹啉甲酸法(BCA法)進行定量分析；加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×，蛋白于95 ℃煮15 min，蛋白樣品總量為25 μL，Marker上樣量為5 μL，100 V、10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)1.5 h；電泳結束后將蛋白轉置甲醇活化后的PVDF膜，5%的脫脂奶粉溶于TBS-T中，將膜放入進行封閉2 h。孵育一抗，分別加入鼠抗人Bax、β-actin抗體，兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3、MRP、P-gp(工作濃度1∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜，TBS-T緩沖液洗滌PVDF膜4次，每次8 min；HRP標記的羊抗兔、兔抗鼠二抗(1∶5 000)37 ℃孵育2 h后洗膜，進行BIO-RAD成像系統拍照，Image J軟件分析灰度結果，每組實驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 紫杉醇聚合物膠束的形貌、粒徑和電位分析 采用“薄膜分散法”制備了紫杉醇長循環膠束納米粒，游離的紫杉醇在PBS中溶解度差，而經搭載的紫杉醇膠束在PBS中溶解性較好，分散較均勻(見圖1A)。紫杉醇膠束經負染后在電鏡下觀察呈圓球形，粒徑30～40 nm，PCS分析水合粒徑也在30 nm左右，與電鏡結果一致(見圖1B、1C)。紫杉醇膠束電位為-5.4 mV，利用紫外分光光度計測得紫杉醇在膠束系統中的載藥量為25.37%(見圖1D)。

2.2 SRB法檢測不同濃度紫杉醇和紫杉醇膠束對乳腺癌耐藥細胞增殖作用的影響 各濃度紫杉醇膠束組細胞存活率均低于紫杉醇組和對照組(P<0.01)(P<0.01)(見表1)。

2.3 紫杉醇和紫杉醇膠束對MCF-7/PR凋亡的影響 采用流式分析實驗對紫杉醇和紫杉醇膠束(1 μmol/L)對MCF-7/PR凋亡的影響進行了研究，與紫杉醇組比較，紫杉醇膠束組誘導乳腺癌耐藥細胞株的凋亡能力更強(P<0.01) (見圖2、表2)。

分組0.1 μmol/L0.5μmol/L1μmol/L對照組101.44±1.86102.21±1.31100.68±1.99紫杉醇組91.09±3.7480.94±8.7267.52±3.73紫杉醇膠束組76.57±0.72??70.30±5.70??55.41±4.49??F78.12121.547183.120P<0.01<0.01<0.01MS組內5.99736.75312.682

q檢驗:與對照組、紫杉醇組比較**P<0.01

分組n早期凋亡率對照組31.24±0.57紫杉醇組31.96±0.25紫杉醇膠束組32.93±1.36??F—11.67P—<0.01MS組內— 0.180

q檢驗:與對照組、紫杉醇組比較**P<0.01

2.4 紫杉醇及紫杉醇膠束對乳腺癌耐藥細胞遷移及侵襲能力的影響 采用劃痕實驗和Transwell 實驗研究了紫杉醇以及紫杉醇膠束組對乳腺癌耐藥細胞侵襲及遷移能力的影響。劃痕實驗結果表明，與對照組相比，紫杉醇組的遷移率明顯下降，而紫杉醇膠束組的遷移率下降更為明顯(見圖3)。Transwell 實驗結果表明，相對于對照組和紫杉醇組，紫杉醇膠束組細胞的侵襲數目和遷移率均明顯降低(P<0.01)(見表3)。

分組n侵襲細胞數/個遷移率/%對照組3162±6.1174.46±2.11紫杉醇組3127±4.3642.92±0.46紫杉醇膠束組3 97±1.53?? 19.80±0.56??F—162.4491357.43P—<0.01<0.01MS組內—19.5561.664

q檢驗:與對照組、紫杉醇組比較**P<0.01

2.5 紫杉醇及紫杉醇膠束對乳腺癌耐藥細胞凋亡蛋白和耐藥相關蛋白的影響 采用蛋白質印跡實驗研究紫杉醇及紫杉醇膠束對乳腺癌耐藥細胞凋亡蛋白和耐藥相關蛋白的影響。與對照組和紫杉醇組比較，而紫杉醇膠束組Bcl-2的表達量明顯減少，Caspase-3以及Bax的表達明顯增加(P<0.01)?；熀竽[瘤細胞產生的MDR常導致化療失敗。MDR與 P-gp 和MRP高表達相關。相對于對照組和紫杉醇組，紫杉醇膠束組能夠明顯抑制P-gp和MRP的表達水平(P<0.01)(見圖4、表4)。

3 討論

腫瘤的多藥耐藥是導致傳統化療失敗的重要原因，與過度表達藥物外排泵、細胞凋亡機制的缺陷、突變的分子靶點、腫瘤的微環境、缺氧及胞外低pH 等機制有關。利用納米顆粒容易進入細胞的特點，納米顆粒作為運載體有效逆轉腫瘤的多藥耐藥。為了探索克服腫瘤耐藥的有效治療方式，本課題選用紫杉醇為模型藥物，設計了一種對腫瘤微環境響應的基于TPGS修飾的PEG-DSPE膠束系統，研究了其在逆轉乳腺癌多藥耐藥性方面的能力。

PEG-DSPE 納米膠束是體內可降解并經FDA批準的可用于人體的藥物載體材料，這種兩親性共聚物能在水介質中形成具有疏水性內核與親水性外殼的超分子聚集體，疏水性內核包載藥物，提高難溶性藥物的溶解度，同時可避免藥物降解；而PEG親水性外殼有助于納米膠束在血液中的長時間循環，因此PEG-DSPE 納米膠束常用于難溶性藥物的增溶載體。

TPGS由維生素E琥珀酸酯的羧基與聚乙二醇1000(PEG1000)的羥基酯化而成，是由美國 FDA 批準的生物安全性高的高分子聚合物。TPGS 具有兩親性結構，由親油性的烷基尾(維生素 E)和親水性的極性頭(PEG)組成，具有良好的生物相容性和理化性質?；赥PGS 的抗腫瘤藥物納米制劑具有藥物包封率高、體內循環時間長、口服生物利用度高等優點。更為重要的是，TPGS 還是一種高效的P-gp抑制劑，能與P-gp非轉運活性位點結合，影響細胞膜的流動性，從而導致 P-gp 構象發生改變。

表4 紫杉醇和紫杉醇膠束處理乳腺癌耐藥細胞后對凋亡相關蛋白和耐藥蛋白表達的影響

分組nMRPP-gpCaspase-3BaxBcl-2對照組31.00±0.0021.00±0.0081.00±0.0051.00±0.0081.00±0.001紫杉醇組30.97±0.0050.95±0.0151.18±0.0121.13±0.0060.85±0.004紫杉醇膠束組30.79±0.005??0.81±0.008??1.33±0.010??1.38±0.048??0.79±0.011??F—2107.01256.28902.97139.20704.85P—<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01MS組內—0.0000.0000.0000.0010.000

q檢驗：與對照組、紫杉醇組比較**P<0.01

細胞凋亡基因過表達凋亡抑制蛋白和膜蛋白介導的藥物外排是產生腫瘤多藥耐藥最為重要的機制。細胞凋亡是由一系列信號分子精密調控的程序性死亡過程，信號傳導過程可以分為兩條基本途徑：外源性的凋亡主要依賴于位于細胞膜表面連接的死亡受體激活Caspase信號通路，而內源性凋亡主要是由Caspase依賴性和非依賴于Caspase的通路激活線粒體內在通路。Bcl-2 和Bax分別是Bcl-2 族中重要的抑制凋亡和促進凋亡蛋白。本研究發現，紫杉醇膠束組能夠更加有效地誘導細胞凋亡，上調Caspase-3、Bax的表達，而Bcl-2 的表達下降，這一結果可能會促使腫瘤耐藥細胞內線粒體膜通透性增加，線粒體發生膨脹，引起下游Caspase-3 的激活，導致細胞凋亡。

P-gp是一種相對分子質量為170 000的跨膜糖蛋白，高度表達于耐藥腫瘤細胞膜上，可能量依賴性地將藥物泵出細胞，并減少藥物轉運進入細胞，使細胞內藥物的蓄積減少，從而產生耐藥性。MRP具有像P-gp一樣的外排抗腫瘤藥物的能力，與ATP結合并水解ATP之后將胞質內的抗腫瘤藥物外排出細胞，從而降低腫瘤細胞內的藥物濃度，降低藥效。因此，提高化療藥物的有效濃度仍然是目前克服腫瘤耐藥的主要可行方法。本實驗利用TPGS修飾的PEG-DSPE膠束搭載紫杉醇，可以有效預防藥物分子被外排泵識別，并且在細胞內釋放藥物。蛋白印跡實驗證明PEG2000-DSPE-TPGS-PTX相對于紫杉醇更有效地減低P-gp和MRP的蛋白表達水平。

根據課題前期預實驗確定了PTX藥物濃度梯度，在所選藥物濃度梯度范圍內進行體外細胞實驗，乳腺癌紫杉醇耐藥細胞株的生長抑制情況存在較明顯的差異性，且濃度選擇均小于IC50，避免了細胞大量死亡而干擾相關實驗指標的檢測，便于觀察對比各組間差異。

另外，乳腺癌病人化療過程中,多西紫杉醇血藥濃度-時間曲線下面積 (AUC)與療效及不良反應相關[14]。根據相關研究數據,中國病人應用多西紫杉醇AUC值的正常范圍可考慮為1.0～3.0 μmol·h-1·L-1。根據AUC正常范圍值調整紫杉醇用量有望減少不良反應的發生[15]。因此，課題實驗紫杉醇濃度選擇為1 μmol/L，可更加合理地指導紫杉醇的臨床應用。

綜上所述，TPGS修飾的紫杉醇長循環膠束給藥系統，可有效在體外發揮抗腫瘤效應及逆轉多藥耐藥作用，可以為開發新型的抗癌藥物給藥系統提供一定的參考依據。