3D打印多孔鈦金屬植入物不同孔隙率對骨長入影響的實驗研究

劉路坦，牛國旗，周乾坤，陳 輝，聶 虎，王震寰

上頸椎畸形伴寰樞關節脫位或不穩常導致脊髓壓迫，嚴重影響病人的生活質量。目前脊柱外科治療這種顱頸交界區疾病的標準術式是后路枕頸融合術，但傳統枕頸融合的內植物存在置釘困難、缺乏良好解剖形態匹配、無孔隙結構等缺陷，無法直接骨長入，只能進行植骨融合，存在融合失敗的風險[1]。有學者發現多孔結構對骨長入有積極的促進作用，并利用3D打印技術設計制造多孔植入物來解決骨長入問題[2-3]。我院脊柱外科團隊利用3D打印等數字醫學技術，研制出一款集固定、置釘、融合為一體的3D打印個體化枕頸融合器(專利號：ZL201721220260.5)，并將其骨接觸面設計為仿骨小梁的多孔結構。但這種多孔結構與顱骨、頸椎后弓表面皮質骨能否像3D打印多孔髖臼杯一樣獲得良好骨長入，尚未見相關報道。為此，我們利用兔長骨皮質骨模擬顱骨與頸椎后弓皮質骨進行實驗，旨在探討3D打印多孔鈦板能否與處理后的皮質骨表面形成有效骨長入從而獲得融合，并確定適宜骨長入的孔隙率，為3D打印枕頸融合器在骨性融合方面提供理論支持?，F作報道。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康新西蘭大白兔18只，兔齡6～8個月，雌雄不限，體質量3.0～3.5 kg，購于南京市江寧區青龍山動物繁殖場[生產許可證號：SCXK(蘇)2017-0011；實驗動物合格證號：No 201803587]，分籠飼養。3D打印多孔鈦板(北京愛康公司提供打印)，3D打印機(上海復志公司)，硬組織切片機(德國艾卡特公司)，硬組織磨片機(德國EXAKT公司)，螺旋CT、X光機(德國西門子公司)。10%水合氯醛，VG染液(上海己博公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔股骨干模型的重建及打印 使用64排螺旋CT對實驗兔進行0.5 mm層厚連續薄層掃描，將掃描的股骨干數據以DICOM格式文件導出，并使用三維重建軟件Mimics 17.0對數據進行重建。將股骨干3D模型數據傳導入ideaMaker軟件進行切片，切片完成后傳入3D打印機進行模型打印。

1.2.2 多孔金屬鈦板的設計 測量股骨干3D模型的直徑、長度等參數。根據兔股骨干形態和所測參數設計多孔鈦板形狀及尺寸：主體形狀為長方形，長10 mm，寬5 mm，厚2 mm，螺孔Φ2.4 mm。鈦板主體結構分為兩層，即骨接觸面多孔層(厚度1.4 mm)和非骨接觸面層(厚度0.6 mm)，孔徑600 μm，孔隙率分為35%、55%和75%。最后利用電子束融化法進行打印(見圖1、2)。

1.2.3 實驗動物建模 實驗兔隨機分為A、B、C組，各6只，分別植入35%、55%、75%孔隙率的3D打印多孔鈦板。術前備皮，禁食、水12 h，術前30 min青霉素肌肉注射預防感染。10%水合氯醛溶液(2.0 mL/kg)耳緣靜脈麻醉。常規消毒，鋪巾。取股骨中段前外側3.0 cm縱行切口，鈍性分離股骨外側肌群，通過肌間隙顯露股骨干。取股骨干中段前外側1 cm×2 cm骨面作為置板區域，以磨鉆小心打磨骨皮質至出現新鮮點狀滲血。使用1.0 mm克氏針在打磨區均勻鉆孔，微孔間距2～3 mm。將3D打印多孔鈦板放置妥當后使用2.4 mm鎖定螺釘固定。反復沖洗切口，逐層縫合。

1.2.4 實驗標本取材與處理 術后第4、16周，分別從3組實驗兔中選取3只，處死后取出股骨并仔細剝離周圍軟組織，用于大體觀察、影像學觀察。依次對股骨干標本進行4%多聚甲醛組織固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、甲基丙烯酸甲酯包埋處理，然后對標本進行切割和打磨拋光處理,切片厚度控制在50 μm左右，最后進行VG染色處理，用于組織學觀察。

1.3 觀察指標 大體觀察：觀察植入鈦板周圍是否有骨膜包被，鈦板與股骨干之間是否有骨組織生成以及與鈦板結合情況。影像學觀察：通過X線片觀察植入鈦板位置及鈦板周圍是否有骨痂形成，鈦板與骨面之間是否有縫隙。組織學觀察：鏡下觀察各標本多孔結構中是否有新生骨組織，并采集圖像信息(每個標本2張)，用Image-pro Plus 6.0軟件對新生骨組織面積進行半定量分析，計算新生骨形成率，新生骨形成率=新生骨組織面積/多孔鈦板內部可供骨長入孔隙的總面積×100%。

1.4 統計學方法 采用單因素方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 實驗兔大體觀察結果 各標本植入的多孔鈦板均固定在位，未見明顯移位現象。術后4周，各組標本鈦板周圍及與骨面間可見纖維組織，未見明顯骨痂形成。術后16周，各組標本鈦板和骨面之間有新生骨組織形成連接，鈦板周圍有較多的骨痂形成，個別鈦板被骨痂包裹(見圖3)。

2.2 實驗兔影像學觀察結果 X線片觀察顯示，各組鈦板均固定在位。術后4周多孔鈦板與骨質之間無明顯骨痂形成，部分鈦板與骨面之間存在有一定間隙。術后16周鈦板周圍均有不同程度的骨痂形成，部分鈦板被骨痂包繞，鈦板與骨面結合緊密，未見明顯間隙(見圖4)。

2.3 組織學觀察 術后16周，A組實驗兔鈦板邊緣可見骨組織長入，但由于孔隙率過低，各孔隙之間空間較小，孔隙內部骨長入欠佳；B組可見一定量的新骨生成并長入孔隙之中，但骨組織與鈦板之間存在一定縫隙，骨-植入物界面骨結合不良，易發生微動影響遠期穩定性；C組鈦板孔隙間空間適宜，各孔隙互有聯通，新生骨組織長入孔隙內部，長入密度較高，且與鈦板結合緊密(見圖5)。3組新生骨形成率間差異有統計學意義(P<0.01)，其中C組均明顯高于A組和B組(P<0.01)，B組亦明顯高于A組(P<0.01)(見表1)。

表1 3組實驗兔術后16周新生骨形成率比較

q檢驗：與A組比較**P<0.01;與B組比較##P<0.01

3 討論

鈦金屬具有密度低、強度高、耐腐蝕、生物力學性能和生物相容性好的特點，是目前已知生物親和力最好的金屬。其彈性模量較其他金屬更接近人體骨骼的彈性模量，成為目前骨科內植物材料的優先選擇[4]。常規鈦植入物表面光滑，內部無孔隙結構，只能單純被纖維組織包裹，主要依賴與宿主骨骼之間的摩擦力和來自螺釘鈦纜的第三方固定來保持穩定，無法完成骨長入過程[5]。為解決這一問題，模擬骨小梁結構的三維孔隙結構被引入鈦植入物的制作之中，利用3D打印技術特殊的制作工藝，將鈦合金制造成多孔植入物。3D打印技術可精確控制多孔結構的孔隙率、孔徑、空間排列等參數。

多孔鈦金屬植入物有以下優點[6-8]：(1)可以通過孔徑和孔隙率的調節來改變彈性模量，減少應力屏蔽效應，實現植入物和宿主骨之間的力學性能的匹配；(2)增加材料比表面積和材料-骨接觸面積，促進骨整合；(3)孔隙的存在可保持細胞形態，為成骨細胞提供黏附和增殖空間，有利于骨長入；(4)孔隙之間相互聯通，有利于氧分和營養物質的運輸以及代謝物的交換。近年多孔鈦金屬植入物從實驗到臨床亦得到了多維度應用。YANG等[9]對實驗綿羊行3D打印多孔鈦合金自穩人工頸椎置換術，組織學觀察顯示骨組織可以順利長入人工椎體孔隙內部，并能維持頸椎的穩定性。ARANDA等[10]利用3D打印制造個體化多孔鈦胸骨，用于因胸壁腫瘤行胸骨切除后的修復，效果得到認可。XU等[3]為一例尤文肉瘤患兒行全球首例3D打印多孔人工定制樞椎的置換，術后恢復良好。

骨長入是指骨組織通過植入物表面或內部的微孔或孔隙結構與植入物完成骨性結合。影響多孔植入物骨長入的因素很多，如孔隙率、孔徑、孔隙連通性、材料的生物相容性、生物活性、應力刺激等[11]。關于適合骨長入的最佳孔隙率，一般認為高孔隙率不影響細胞黏附，可提供利于營養物質和氧流動、運輸的空間，促進細胞增殖和骨髓間充質干細胞成血管化，有利于骨長入；孔隙率過小則導致孔隙空間狹窄，缺少有效聯通，細胞增殖到一定范圍會產生“接觸抑制”[12]。CHENG等[13]在制作的15%、38%、70%孔隙率多孔鈦支架上培養細胞后發現高孔隙率較低孔隙率更利于細胞分化。王雷等[14]將兔骨髓間充質干細胞加入40%和70%孔隙率的多孔鈦合金支架中，培養72 h后發現70%孔隙率較40%孔隙率更適宜細胞的黏附和增殖。有學者[15]通過觀察翻修的生物型多孔假體，發現多孔結構里新生骨占比不到10%，并且孔隙內骨質交聯較少，考慮這種現象可能與假體的孔隙率過低有關。

但并不是孔隙率越高越有利于骨長入。LV等[16]通過向多孔金屬假體中植入骨髓間充質干細胞，發現73%孔隙率組的細胞活性和分化情況均優于81%孔隙率組。周鵬等[17]分別將3種孔徑和孔隙率均不相同的3D打印鈦合金假體植入兔股骨髓腔，結果表明，262 μm孔徑、68.1%孔隙率的假體在骨體積分數、組織礦物密度和最大拔出力等方面均高于558 μm孔徑、79.2%孔隙率和753 μm孔徑、89.0%孔隙率假體。另外，也有少數文獻稱中、高孔隙率對骨長入的影響無顯著差異，如KUJALA等[18]構建鼠股骨缺損模型并植入47%和66%孔隙率的鎳鈦合金支架，結果顯示2組孔隙率對成骨的影響并無統計學差異。

本實驗結果顯示，75%孔隙率的鈦板孔隙中新骨形成率達到36.96%，明顯高于其他2組的新骨形成率。分析其原因可能是75%孔隙率比例合適，孔隙間連通性高，為成骨細胞提供足夠生長空間，更易于氧和營養物質運輸；多孔鈦板為貼附融合，孔隙結構厚度有限，35%孔隙率過于緊密，孔隙間無法形成有效交通，導致新骨組織局限在外圍，無法深入其中。

目前，對于像本實驗這種以多孔植入物在顱頸表面、長骨骨皮質骨表面直接貼合形式的骨長入研究鮮有文獻報道。因此，本研究具有一定的創新性，可以為此類骨長入研究提供參考。但本實驗也存在一些局限和不足之處：(1)相關研究不多，缺乏大量相關文獻的支持，結果評價標準有限也缺乏統一；(2)樣本量不多，長入時間有限，未能觀察更長時間骨長入情況。因此，在后續的實驗中還需要針對存在的問題進行完善。

綜上所述，本研究發現3D打印多孔鈦板的孔隙結構，可以允許新生骨長入；不同孔隙率大小，影響3D打印鈦金屬植入物的新生骨長入效果；35%、55%、75%三種孔隙率中，75%孔隙率較其他兩組較低孔隙率更有利于骨長入；75%孔隙率3D打印多孔鈦板可與經適當處理的皮質骨表面實現良好的骨性融合。實驗具有一定的科學性和創新性，可為3D打印個體化定制枕頸融合器在骨性融合方面提供參考。