尿IL-18、轉鐵蛋白和β2微球蛋白在新生兒窒息致急性腎損傷早期診斷中的價值

張麗亞 陳黎麗 羅芳

新生兒窒息可致多臟器功能損傷甚至衰竭，是我國新生兒死亡和致殘的重要因素之一[1]。新生兒窒息常導致急性腎損傷（AKI），并可發展成急性腎功能衰竭[2]。目前臨床上主要采用血清肌酐（Scr）、尿量等指標進行診斷，但其靈敏度較差，加上新生兒腎功能的影響因素較為復雜，當Scr發生明顯變化時，患兒腎功能損害已非常明顯，往往失去了早期干預的機會；同時反復抽血檢測也會對患兒造成傷害。相對于血液，尿液更容易獲取且無創傷。Scr僅反映腎小球濾過功能，但腎濾過功能具有強大的代償能力，當功能損傷超過50%時Scr才開始升高。然而，尿液指標能更全面反映腎臟功能，如尿微量白蛋白、β2微球蛋白（β2-MG）等。此外，腎損傷時也會分泌一些物質并隨尿排出體外，這些物質在尿液中的濃度可反映腎損傷的程度。研究表明，與尿微量白蛋白比較，尿轉鐵蛋白（TRF）反映腎小球濾過膜的屏障功能受損更靈敏[3]。IL-18是主要由活化的單核細胞、巨噬細胞分泌的前炎癥因子，具有免疫誘導功能，當腎損傷時會分泌IL-18并隨尿液排出，可反映腎損傷的程度。本研究通過檢測尿IL-18、TRF和β2-MG等指標，探討這些指標對新生兒窒息致AKI早期診斷的價值，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年7月至2018年10月在本院出生的發生窒息合并AKI足月新生兒50例、發生窒息未診斷AKI足月新生兒50例、同期健康的足月新生兒50例（正常對照組）為研究對象。納入標準：38周≤胎齡＜42周；2.5kg≤出生體重＜4.0kg。排除患有泌尿系統先天畸形、圍生期感染等非窒息因素導致影響腎功能的疾病者。AKI的診斷與分級標準參考2012國際改善全球腎臟疾病預后組織關于AKI的指南：48h內Scr≥26.5μmoL/L，已知或推測過去7d內Scr≥基線值1.5倍，或持續6h尿量＜0.5ml/（kg·h）為急性AKI，具體見表1。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集并比較3組對象的一般資料，包括性別、胎齡、體重、出生后Apgar評分（8～10分為正常，0～7分為窒息）、48h Scr變化值、48h尿量等。

1.2.2 實驗室檢測 （1）尿IL-18、TRF、β2-MG檢測：分別留取新生兒出生后 0～6h、6～12h、12～24h、24～48h 等 4個時段的新鮮尿液2ml，1500r/min離心5min，存于-80℃冰箱內備用。Human IL-18 Platinum ELISA試劑盒（ARG80138）由美國 eBioscience公司提供，在 Wallac Victor 1420型酶標儀460nm讀取結果；尿β2-MG檢測試劑（20180327）由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供，使用中國Autolumo A2000Plus全自動生化分析儀以磁微?；瘜W發光法進行檢測；尿TRF檢測試劑（M808234）由貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司提供，使用美國貝克曼庫爾特公司提供的IMMAGE 800免疫分析儀以免疫透射比濁法進行檢測。（2）Scr檢測：對于新生兒窒息者，盡早抽取靜脈血2ml，4 000r/min離心5min，檢測 Scr；抽血 48h 后再取靜脈血 2ml，檢測 Scr。Scr檢測試劑（20180402）由寧波美康生物科技有限公司提供，使用美國貝克曼AU680型全自動生化分析儀進行檢測。

1.3 統計學處理 應用SPSS 18.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內不同時段比較采用重復測量的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。不同時間段尿IL-18、β2-MG、TRF對新生兒窒息致AKI的診斷效能評價采用ROC曲線分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 AKI診斷與分級標準

2 結果

2.1 3組對象一般資料比較 3組對象性別、胎齡、體重比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；Apgar評分、48h Scr變化值、48h尿量比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 2。

表2 3組對象一般資料比較

2.2 3組對象不同時段尿IL-18、β2-MG、TRF比較 除出生后0～6h尿TRF外，其余不同時段尿IL-18、β2-MG、TRF3組對象比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。窒息合并AKI組4個時段尿IL-18、β2-MG、TRF比較，以及窒息未診斷AKI組4個時段尿β2-MG、TRF比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；正常對照組4個時段尿IL-18、β2-MG、TRF比較，以及窒息未診斷AKI組4個時段尿IL-18比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 3。

表3 3組對象不同時段尿IL-18、β2-MG、TRF比較

2.3 窒息合并不同AKI分級患兒不同時段尿IL-18、β2-MG、TRF比較 依據2012國際改善全球腎臟疾病預后組織關于AKI的指南，AKIⅠ級23例，Ⅱ級19例，Ⅲ級8例。隨著AKI分級增高，各時段尿IL-18、β2-MG及TRF不斷增高；隨著尿標本留取時間的延長，AKI患者尿IL-18、β2-MG及TRF不斷增高，見表4。

2.4 不同時間段尿IL-18、β2-MG、TRF對新生兒窒息致AKI的診斷效能 0～6h尿IL-18的診斷效能最高，AUC為0.65；6～12h尿β2-MG的診斷效能最高，AUC為0.85；12～24h尿 β2-MG、TRF 的診斷效能最高，AUC 均為 0.96；24～48h 尿 β2-MG、TRF 的診斷效能最高，AUC均為1.00。3者聯合診斷效能均優于單項指標，0～6h、6～12h、12～24h、24～48h 的 AUC 分別為 0.77、0.96、1.00、1.00，見圖 1。

3 討論

新生兒窒息后并發癥往往累及多器官，主要包括心、腦、腎等[4]。新生兒窒息后，機體血液通過潛水反射重新分布并優先保證心、腦、腎上腺等重要臟器的血供，而通往腎臟組織的血流迅速減少，易造成腎損傷。據報道，我國新生兒窒息發生率約為5%[5]；而窒息又是腎損傷的第一病因[6]。對于腎損傷，早期診斷與干預是降低腎損傷病死率的關鍵。但不少患兒雖出現不同程度的急性腎功能異常，但未達到腎衰竭的標準，可能失去早診斷早干預的時機，最終可發展為終末期腎病。近年來，國際上用AKI的標準取代傳統的急性腎功能衰竭，為腎臟早期損傷的診斷提供依據。AKI表現為突然或連續性的腎功能衰退，涵蓋了從腎功能微小改變到腎功能衰竭的整個過程。據報道，新生兒窒息致急性腎功能衰竭的比例接近10%，而AKI的比例超過60%[7-8]。

表4 窒息合并不同AKI分級患兒不同時段尿IL-18、β2-MG、TRF比較

圖 1 不同時間段尿 IL-18、β2-MG、TRF 診斷新生兒窒息致 AKI的 ROC 曲線（a：0～6h，AUCIL-18=0.65，AUCβ2-MG=0.62，AUCTRF=0.57，AUC聯合 =0.77；b：6～12h，AUCIL-18=0.79，AUCβ2-MG=0.85，AUCTRF=0.76，AUC 聯合 =0.96；c：12～24h，AUCIL-18=0.89，AUCβ2-MG=0.96，AUCTRF=0.96，AUC聯合 =1.00；d：24～48h，AUCIL-18=0.96，AUCβ2-MG=1.00，AUCTRF=1.00，AUC 聯合 =1.00）

2001年Bellomo等[9]首次提出了AKI。2002年急性透析質量專家組提出了AKI的分級標準[10]，并將其分為風險期（R）、損傷期（I）、衰竭期（F）、失功能期（L）和終末腎病期（E），簡稱RIFLE分級標準。由于其分級診斷主要依據Scr較基線值升高倍數和eGFR確定，而Scr與GFR變化并不完全一致；加上很多患者并無基礎腎功能指標監測值，依據Scr較基線值升高倍數進行診斷與分級存在問題。為提高診斷的靈敏度，2005年AKI工作網絡（AKIN）對RIFLE分期標準進行簡化，即AKIN診斷標準。RIFLE標準強調與以往狀態的比較以及腎功能變化的累積效應，而AKIN標準強調短期內上升幅度及腎功能變化速度[11]。2012年國際改善全球腎臟病預后組織在RIFLE和AKIN標準基礎上對AKI標準再次進行修訂并發表了AKI指南，明確了急性AKI的診斷標準；當患者Scr和尿量符合不同分級時，選擇最高分級。但該標準評價腎功能的主要指標是Scr和尿量，由于新生兒Scr和尿量受多種因素影響，不同個體新生兒的尿量差異很大，加上新生兒Scr的正常參考值尚無統一標準，基線值難以確定；因此，目前該診斷標準用于新生兒AKI的評價受到限制。

目前Scr檢測僅能反映腎小球濾過功能受損程度，而腎小球濾過功能具有強大的代償能力，只有當濾過功能損傷超過50%時Scr才升高。因此，可認為在發生窒息而未達到AKI診斷標準的患兒中，有相當一部分患兒實際上已發生腎損傷。腎臟功能包括腎小球濾過功能和膜屏障功能，以及腎小管的重吸收、尿液濃縮及酸堿調節功能等。多項研究結果表明，腎小管功能在反映腎損傷時較腎小球更為靈敏[12-13]。另外，當腎損傷時會分泌一些物質并隨尿液排出體外，因此本研究以反映腎小球濾過膜屏障功能受損的TRF、反映腎小管重吸收功能的β2-MG以及腎損傷時分泌的IL-18作為觀察指標，探討其在新生兒窒息致腎損傷早期診斷中的價值。TRF為單鏈糖蛋白，在肝臟內合成，生物半衰期7～10d，分子質量與白蛋白接近，多項研究表明其可作為反映腎小球膜屏障功能的標志物[14-15]。此外，TRF所帶負電荷較微量白蛋白少，更易通過帶負電荷的腎小球濾過膜，在檢測早期腎小球損傷方面較微量白蛋白更靈敏。尿β2-MG是細胞表面人白細胞抗原的β鏈（輕鏈）部分，分子質量11 800，由99個氨基酸組成的單鏈多肽。它可從腎小球自由濾過，99.9%在近端腎小管吸收，并在腎小管上皮細胞中分解破壞，故在正常情況下尿β2-MG濃度很低。當腎小管受損時，尿β2-MG明顯增高，是反映腎小管重吸收功能的理想指標[16]。IL-18是一種主要由活化的單核巨噬細胞分泌的前炎癥細胞因子，能誘導包括IFN-γ在內的多種細胞因子，還可通過細胞凋亡蛋白酶-1（Caspase-1）的激活參與炎癥及免疫反應，具有重要的免疫調節功能，參與多臟器局部缺血性損傷等過程[17]。Caspase-1和IL-18主要表達腎小管上皮細胞中，當腎臟受到血流灌注下降等急性損傷時，Caspase-1激活IL-18前體并裂解為有活性的IL-18，對腎臟起保護作用，同時增高的IL-18隨尿排出。多項研究結果顯示，尿IL-18指標對多種因素引起的AKI具有良好的診斷與預后評估價值，且尿IL-18增高遠早于Scr的增高[18-21]。本研究結果顯示，與正常對照組比較，窒息未診斷AKI組各時間段尿TRF、β2-MG和IL-18均有不同程度的升高，說明在窒息未診斷AKI患兒中有腎損傷發生。在窒息合并AKI組中，48h內尿TRF、β2-MG和IL-18均隨尿標本留取時間的延長而增高。在窒息未診斷AKI組中，3項指標在6～12h尿液中濃度均高于0～6h，之后除IL-18下降不明顯外，TRF、β2-MG均有不同程度的下降；提示在窒息未診斷AKI患者0～6h尿液中，3項指標均會出現明顯升高過程，隨后回落。在窒息未診斷AKI組、窒息合并AKI組中，0～6h尿IL-18、β2-MG均有所增高。ROC曲線分析發現，0～6h尿IL-18在區分窒息未診斷AKI與窒息合并AKI的診斷效能最佳；分析原因可能是IL-18為前炎癥細胞因子，在腎臟組織細胞發生凋亡以及腎臟功能受損前就已升高。窒息未診斷AKI組與窒息合并AKI組6～12h尿TRF開始升高，提示可能在窒息引起的AKI中，腎小球的膜屏障功能受損出現的時間相對較晚；此外，該時段尿β2-MG的診斷效能優于 IL-18。12～24h、24～48h 尿 TRF、β2-MG 診斷效能均優于IL-18；原因可能是在窒息未診斷AKI患兒尿IL-18保持較高水平。同時發現，3者聯合診斷效能明顯高于單一指標；12～24h尿液指標檢測結果就能將窒息未診斷AKI與窒息合并AKI患兒完全區分，明顯縮短了AKI的診斷時間。此外，對不同AKI分級患兒尿TRF、β2-MG和IL-18分析發現，3項指標濃度隨分級增高而增高，提示具有反映病情進展的作用。

綜上所述，尿IL-18、β2-MG和TRF在新生兒窒息致AKI早期診斷中具有一定的臨床價值，0～6h尿IL-18診斷效能最高，之后其診斷效率低于TRF和β2-MG，3者聯合診斷效能優于單項指標，可明顯縮短診斷時間，同時采取尿液作為檢測標本可減少對患兒的傷害。但是，嚴重腎損傷患兒可出現持續無尿；另外由于新生兒處于特殊代謝時期，各指標的個體差異較大，對最終結果可能造成影響，在一定程度上具有局限性。