白芍總苷抑制局灶性腦缺血大鼠海馬神經元損傷的機制研究

李紅霞 張益明 陳剛 徐立 陳小麗 代小蘭

海馬神經元與機體多種神經系統功能密切相關，尤其是空間學習記憶能力[1-2]。因此，抑制海馬神經元損傷對改善缺血性腦損傷患者的臨床癥狀具有至關重要的作用。白芍總苷為毛茛科白芍屬植物白芍的活性成分，既往研究發現芍藥苷能夠改善大鼠認知功能障礙并調節海馬神經因子[3]。本研究就白芍總苷對局灶性腦缺血損傷大鼠海馬神經元的保護作用及其機制作一探討，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 無特定病原體（SPF）級8周齡雄性SD大鼠，體質量230～260g，購自寧波大學實驗動物中心[SYXK（浙）2014-0005]，動物批次號：20181030006。實驗前清潔環境飼養1周，每天光照12h+黑暗12h，恒室溫25℃，相對濕度50%～70%，自由飲水、進食。

1.2 主要試劑 白芍總苷膠囊（國藥準字H20055058，0.3g/粒，批號201712005，寧波立華制藥有限公司）；NF-κB、B 細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關 X 蛋白（Bax）多克隆抗體和二喹琳甲酸法（BCA）測定試劑盒（批號 201710013、201801007、201712011、201803002，上海碧云天生物技術有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒及TUNEL 試劑盒（批號 20180116、20180305、20180324、20171109，南京建成生物工程研究所）；IL-1β、IL-6、TNF-α 的 ELISA 試劑盒（批號 180117、171230、171125，北京華英生物技術研究所）。

1.3 主要儀器 Multiskan MK-3型酶標儀（芬蘭Thermo公司）；SZ-1型組織勻漿器（江蘇金壇市晶玻實驗儀器廠）；DYY-6B型穩壓穩流電泳儀（北京六一儀器廠）；DU700型紫外可見分光光度計（美國Beckman Coulter公司）；H-7650型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；RM2125型石蠟切片機（德國Leica公司）；BH-2型倒置光學顯微鏡及攝像（日本Olympus公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型建立 參照王新鳳等[4]報道的實驗方法，建立局灶性腦缺血大鼠模型。（1）線栓制作：取直徑0.235mm釣魚線并剪制3.5cm長度分段，輕輕灼燒一側呈釘子帽狀，在距離“釘子帽”一側18～20mm處作標記，備用。（2）模型制備：大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，頸部正中作切口，剝離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈（充分暴露3者分叉處），結扎頸外動脈，于頸總動脈分叉處近心端作一切口，插入線栓至頸內動脈，遇阻力停止，深度距分叉處約18mm，固定線栓后逐層縫合，消毒。假手術組大鼠除不插入線栓外，其余操作同模型組。

1.4.2 分組與給藥 將造模成功的100只大鼠按隨機數字表法分為模型組、白芍總苷高劑量組（200mg/kg）、中劑量組（100mg/kg）、低劑量組（50mg/kg），每組 25只；假手術組大鼠25只。術后第2天開始灌胃給藥，白芍總苷高、中、低劑量組分別將相應劑量的白芍總苷溶于3ml的0.9%氯化鈉溶液中，假手術組和模型組給予等量的0.9%氯化鈉溶液；1次/d，共28d。

1.4.3 海馬神經元病理學觀察 每組大鼠隨機取10只，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后開胸、暴露心臟，于左心室植入一灌注針頭、右心耳作一切口，快速灌洗0.9%氯化鈉溶液，直至右心耳切口處流出的液體清澈停止；再用4%多聚甲醛溶液繼續灌注固定，灌注速度由快變慢，待大鼠完全僵硬后，斷頭取腦分離出海馬組織，置4%多聚甲醛溶液固定24h，石蠟包埋、切片（厚2μm），二甲苯透明、梯度乙醇脫蠟、水化處理，再行HE染色。在倒置光學顯微鏡下觀察并照相保存。

1.4.4 海馬神經元凋亡情況觀察 取上述制備的海馬組織石蠟切片，經脫蠟、水化處理后，進行TUNEL法染色。在倒置光學顯微鏡下觀察并照相，細胞核棕黃色為陽性著色。每只大鼠隨機取5張染色切片，每張切片取5個互不重疊的視野，計數每個視野細胞總數及凋亡細胞數。凋亡指數（AI）=（凋亡細胞數/細胞總數）×100%。

1.4.5 超微結構觀察 取各組5只大鼠，按上述方法心臟灌流固定至肝臟顏色明顯變淡時，立即斷頭取腦并分離出海馬組織，切割成約1mm3小塊后置4℃預冷的3%戊二醛溶液中，于4℃冰箱內固定2h；PBS浸洗30min，置1%四氧化鋨溶液中，于4℃冰箱內再固定2h；依次經梯度乙醇脫水、還氧丙烷置換、環氧樹脂Epon812浸透、包埋、聚合、光學顯微鏡下定位，超薄切片（60nm）經醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，在10 000倍透射電子顯微鏡下觀察海馬神經元超微結構并拍照。

1.4.6 凋亡相關蛋白（NF-κB、Bcl-2、Bax）表達檢測 采用Western blot法。（1）蛋白提?。喝「鹘M剩余10只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后，迅速置PBS凍結的冰塊上取腦并分離出海馬組織，置離心管中加入9倍量放射免疫沉淀法蛋白裂解液，將離心管置于盛有冰水混合物的燒杯中，研磨勻漿，低溫高速離心（4℃，12 000rpm）15min后取上清液，-70℃冰箱保存，備檢。（2）總蛋白含量測定：嚴格按照BCA測定試劑盒說明進行操作，使用酶標儀測定562nm處吸光度值，根據測定的標準曲線計算總蛋白濃度。（3）Western blot檢測：蛋白樣本經沸水10min高溫變性處理后，上樣、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳（電壓130V，待溴酚藍電泳至凝膠底部時停止）、轉PVDF膜（電壓100V、2h），麗春紅溶液染膜、洗膜，5%脫脂奶粉封閉 1h，滴加一抗[NF-κB、Bcl-2、Bax、β-actin（1:500）]，4℃搖床過夜；洗膜后滴加二抗（1:100），室溫搖床孵育1h；洗膜后滴加電化學發光底物，室溫孵育1min。利用凝膠成像系統對膠片上相應條帶進行掃描，通過條帶灰度值計算蛋白含量。

1.4.7 抗氧化酶（SOD、CAT）活性及MDA含量檢測 取上述海馬組織勻漿液，嚴格按照各試劑盒說明進行操作。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，生化分析法測定CAT活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量。

1.4.8 炎癥細胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平檢測 取上述海馬組織勻漿液，嚴格按照ELISA檢測試劑盒說明進行操作，使用酶標儀測定IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.5 統計學處理 應用SPSS 15.0統計軟件。計量資料用表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白芍總苷對局灶性腦缺血大鼠海馬神經元病理學改變的影響 假手術組大鼠海馬神經元結構完整清晰、排列整齊、層次清晰（呈3～5層），未見異常；模型組海馬神經元數量減少、間隙增大、層次不清，細胞邊界不清、胞體腫脹變大、核固縮偏移等，呈明顯病理性形態結構改變；白芍總苷低、中、高劑量組海馬神經元上述病理性改變較模型組不同程度減輕，高劑量組最明顯：神經元排列較為整齊、細胞分界清晰，可見少量神經元形態結構異常，見圖1（插頁）。

圖1 各組大鼠海馬神經元病理學檢查結果（a：假手術組；b：模型組；c：低劑量組；d：中劑量組；e：高劑量組；HE染色，×200）

2.2 白芍總苷對局灶性腦缺血大鼠海馬神經元凋亡的影響 模型組大鼠海馬神經元凋亡數量明顯多于假手術組，白芍總苷低、中、高劑量組海馬神經元凋亡數量較模型組不同程度減少，見圖2（插頁）。模型組AI為（58.76±9.48）%，明顯高于假手術組的（2.37±0.98）%，差異有統計學意義（P＜0.05）；白芍總苷中、高劑量組AI分別為（31.84±7.09）%、（25.47±6.28）%，均低于模型組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；白芍總苷低劑量組AI為（49.93±10.27）%，與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠海馬神經元凋亡情況（a：假手術組；b：模型組；c：低劑量組；d：中劑量組；e：高劑量組；TUNEL法，×200）

2.3 白芍總苷對局灶性腦缺血大鼠海馬神經元超微結構的影響 假手術組大鼠海馬神經元超微結構未見異常。模型組海馬神經元出現明顯的病理性超微結構改變，包括胞膜破裂、碎片；胞漿溶解呈空泡狀；核膜破裂、核仁邊界不清、周圍間隙增大；線粒體數量減少、體積增大、嵴斷裂溶解、嵴內間隙增大；內質網顆粒脫落；高爾基體腫脹變大等。白芍總苷低、中、高劑量組上述病理性超微結構改變較模型組呈不同程度減輕，其中高劑量組最顯著，見圖3（插頁）。

圖3 各組大鼠海馬神經元超微結構（a：假手術組；b：模型組；c：低劑量組；d：中劑量組；e：高劑量組；透射電子顯微鏡，×10 000）

2.4 白芍總苷對局灶性腦缺血大鼠海馬Bcl-2、Bax、NF-κB蛋白表達及Bcl-2/Bax的影響 模型組大鼠海馬 Bcl-2、Bax、NF-κB蛋白較假手術組均明顯上調，Bcl-2/Bax降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；白芍總苷中、高劑量組大鼠海馬Bcl-2蛋白表達上調，Bax、NF-κB蛋白表達明顯下調，與模型組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1和圖4。

表1 各組大鼠海馬Bcl-2、Bax、NF-κB蛋白表達及Bcl-2/Bax比較

圖4 各組大鼠海馬Bcl-2、Bax、NF-κB蛋白表達的電泳圖（a：假手術組；b：模型組；c：低劑量組；d：中劑量組；e：高劑量組）

2.5 白芍總苷對局灶性腦缺血大鼠海馬SOD、CAT活性和MDA含量的影響 與假手術組比較，模型組大鼠海馬SOD、CAT活性均明顯降低，MDA含量明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與模型組比較，白芍總苷中、高劑量組大鼠海馬SOD、CAT活性均明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 2。

2.6 白芍總苷對局灶性腦缺血大鼠海馬IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響 與假手術組比較，模型組大鼠海馬IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與模型組比較，白芍總苷中、高劑量組大鼠海馬IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3。

表2 各組大鼠海馬SOD、CAT活性及MDA含量比較

表3 各組大鼠海馬IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（nmol/L）

3 討論

腦血管病是臨床常見病、多發病，其中缺血性腦血管病占70%以上，具有高致殘率和高致死率，嚴重危害著人類生命與建康[5-6]。海馬是與認知、學習記憶功能密切相關的腦區，而海馬神經元對缺血、缺氧最為敏感[7-8]，因此保護海馬神經元對減少認知障礙等并發癥具有重要作用。

白芍總苷是我國傳統中藥白芍的主要活性成分，具有多種藥理學活性。本研究發現白芍總苷能明顯改善局灶性腦缺血大鼠海馬神經元層次不清、排列紊亂、神經元數量減少、間隙增大、胞體腫脹變大、核固縮偏移等病理性改變；抑制神經元凋亡；抑制神經元細胞膜、細胞質、細胞核、細胞器等出現的超微結構病變。病理生理學研究發現，多種機制參與腦缺血所致海馬神經元損傷病理過程，其中氧化應激[9-10]、炎癥級聯反應[11-12]、細胞凋亡[11]具有重要的作用。腦缺血后氧自由基大量生成、抗氧化酶（SOD、CAT）失活及過度消耗是導致氧化應激的根本原因，氧自由基能氧化不飽和脂肪酸并破壞細胞膜，還能損傷核酸、引發DNA斷裂等；脂質過氧化最終產物為MDA，其含量與氧自由基數量呈正相關，是評價氧化應激損傷程度的敏感指標[13]。白芍總苷是一種天然抗氧化劑，具有良好的抗氧化作用[14]，本研究發現白芍總苷能明顯提高局灶性腦缺血大鼠缺血側海馬SOD、CAT活性并降低MDA含量；提示白芍總苷能恢復缺血側海馬已耗盡的抗氧化能力，從而抑制其氧化應激反應。

腦缺血能病理性刺激小膠質細胞和星形膠質細胞，從而過度釋放炎癥因子（如細胞因子、趨化因子、基質金屬蛋白酶等），進一步促進內皮細胞黏附分子的表達，使缺血區腦組織炎癥細胞、中性粒細胞聚集[15]；中性粒細胞可分泌細胞因子而進一步活化膠質細胞[16]，從而形成炎癥級聯反應?；罨男∧z質細胞、星形膠質細胞和神經細胞內炎癥細胞因子IL-1β表達上調，而IL-1β水平升高可刺激另一種炎癥細胞因子IL-6表達上調[17]，IL-6水平與腦梗死體積密切相關。因此，IL-6可作為腦組織損傷的評價指標[18]。TNF-α是一種促炎細胞因子，腦缺血早期即可檢測到TNF-α表達上調。有研究證實，通過阻斷TNF-α表達能降低DNA碎片、減輕缺血側腦損傷[19]。李振彬等[20]研究證實，白芍總苷具有炎癥抑制作用。本研究結果發現，白芍總苷能明顯降低局灶性腦缺血大鼠缺血側海馬IL-1β、IL-6、TNF-α水平，提示白芍總苷具有抑制缺血側海馬炎癥反應的作用。

腦缺血發生后，缺血核心區神經元在數小時甚至幾分鐘內即發生不可逆壞死，而缺血核心區與正常腦組織之間的“半暗帶”神經元死亡以凋亡為主要表現。細胞凋亡機制非常復雜，多種蛋白或活化蛋白酶參與凋亡過程的調控。Bcl-2蛋白家族通過影響線粒體膜通透性而在細胞凋亡信號傳導中發揮重要作用[21]，其中抗凋亡蛋白Bcl-2能將凋亡激活因子（Apaf-1）固定在線粒體膜上，從而抑制其發揮凋亡誘導作用。Bcl-2能通過抑制谷胱甘肽外泄而調控細胞內氧化還原電位，從而控制膜電位、抑制細胞凋亡；此外，促凋亡蛋白Bax為小分子細胞色素C提供通道，由線粒體進入胞質而促進細胞凋亡，而Bcl-2蛋白能與Bax蛋白形成同源二聚體，抑制Bax活性，關閉Bax通道而阻止小分子通過，從而拮抗Bax促凋亡作用。因此Bcl-2/Bax可反映兩者在細胞凋亡調控中的作用[22]。氧自由基是NF-κB蛋白的重要激活劑[23]，活化NF-κB蛋白能進入細胞核，并與凋亡相關基因cmyc結合，從而促進其轉錄表達，在細胞凋亡過程中發揮重要作用。齊晅等[24]研究發現，活化NF-κB蛋白在炎癥反應與細胞凋亡之間具有重要的橋梁作用。本研究結果發現，白芍總苷能明顯上調局灶性腦缺血大鼠海馬Bcl-2蛋白表達，下調 Bax、NF-κB蛋白表達，提高Bcl-2/Bax，這可能是白芍總苷抑制缺血側海馬神經元凋亡的重要分子機制。

綜上所述，白芍總苷對局灶性腦缺血大鼠海馬神經元病理性改變及超微結構病變具有保護作用，作用機制可能與其調控凋亡相關蛋白表達、抑制氧化應激和炎癥級聯反應有關。