伴不同gH基因型人巨細胞病毒感染的免疫性血小板減少癥患兒臨床特征研究

張小同 陳露燕

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一種獲得性免疫介導的疾病，其特征為由于血小板破壞過多或產血小板減少引起的外周血血小板減少，以廣泛的皮膚黏膜出血為主要臨床表現。ITP是兒童常見的出血性疾病，發病率約為（4～5）/10萬，5歲以下兒童多見，約7/10萬，兒童男性發病率較女性高。大部分患兒于發病后1～6個月內痊愈，10%～20%患兒呈慢性病程。病死率為0.5%～1.0%，主要致死原因為顱內出血。約2/3 ITP患兒有前驅感染史，其中人巨細胞病毒（hu－man cytomegalovirus，HCMV）感染率較高，陽性率約20%～50%[1-2]。

HCMV的基因為線性雙股DNA分子，長約240 kb，由長單一序列（long unique sequence，UL）和短單一序列（short unique sequence，US） 組成。包膜糖蛋白 H（glycoprotein H,gH）是HCMV進入宿主細胞所需的兩種糖蛋白復合物（gH/gL/gO和gH/gL/UL128/UL130/UL131A）的主要組成成分。已有研究顯示，HCMV gH基因多態性與疾病分布、臨床表現存在相關[3-4]。本研究針對伴HCMV感染的ITP患兒，研究gH基因多態性與其臨床表現、預后的關系，為臨床診治及科學研究提供參考。

1 對象和方法

1.2 Taqman探針熒光定量PCR檢測gH基因型

1.2.1 儀器和試劑 采用ABI7500熒光定量PCR儀（美國應用生物系統公司）。在gH基因兩端的保守區設計引物，正向引物序列：TGTTTTCACGCAGGAAGCGG，反向引物序列：TGGATCACGCCGCTGAACC。在gH基因的分型位置設計兩種探針，一種探針識別gHl分型，另一種探針識別gH2分型。gHl型探針5′端用FAM標記，3′端用 BHQl標記，序列：FAM-CATCCGAAGCGCTGGACCCTCACG-BHQ1；gH2 型探針 5′端用 HEx 標記，3′端用 BHQl標記，序列：HEX-TATCCGAACCGCTGGACAAAGCG-BHQ1。引物、探針均由寶生物公司（日本大津市）合成。

1.2.2 方法 采用RTFQ PCR法同時進行HCMV定量及gH分型。利用熒光雜交探針在一次PCR反應中同時檢測和鑒別HCMV gH1和HCMV gH2基因型。該方法能夠快速、穩定、明確區分兩種HCMV gH基因型[9]。

1.3 治療 ITP治療方案參考2013年《兒童原發性免疫性血小板減少癥診療建議》[12]：（1）PLT＜20×109/L，伴活動性出血或有治療要求予抗ITP治療；（2）PLT（20～100）×109/L，無活動性出血，1～3d 監測血常規；（3）PLT恢復至100×109/L后每1～2周監測血常規，至少隨訪3個月?？共《局委熤刚骱头桨竻⒖?012年中華醫學會《兒童巨細胞病毒性疾病診斷和防治的建議》[8]。

1.4 預后評估[5]完全恢復：3個月內PLT恢復至100×109/L（相隔7d以上測定2次）。持續性 ITP：PLT＜100×109/L持續超過3個月。

1.5 統計學處理 采用SPSS 14.0統計軟件。正態分布計量資料用表示，組間比較采用t檢驗；非正態分布計量資料用中位數及范圍表示，組間比較用非參數檢驗。計數資料用百分比（%）表示，組間比較用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統計學差異。

2 結果

2.1 一般資料 研究期間共新診斷136例ITP患兒，66例HCMV DNA陽性，陽性率48.5%，因19例失訪，故41例新診斷ITP納入本研究。其中gH1組26例（63.4%），gH2組型15例（36.6%）；男27例，女14例，男女比例1.9:1，兩組男性比例無統計學差異（15/26比12/15，χ2=2.105，P=0.147）；月齡中位數 4.0（0，15）個月，gH1組月齡 3.5（0，15）個月，和 gH2 組[月齡 4.0（0,15）個月]比較差異無統計學意義（Z=-0.736，P=0.462），其中＜1歲嬰兒37例，占90.2%。

2.2 不同發病時間ITP患兒的HCMV gH基因型分布情況 將41例新診斷ITP患兒按不同HCMV發病時間將患兒分為3組，＜3周為先天性感染組，＜3月齡為圍生期感染組，≥3月齡為生后感染組。3組患兒的gH基因型分布情況見表1。

“嗯，你別慌、別急！”李曉英從一旁戰士們的哄笑聲中，明白恭建兵是故意在捉弄自己、戲耍自己，從容應答著。冷不丁，一針管對準恭建兵的屁股蛋子扎了過去。

表1 不同發病時間ITP患兒的HCMV gH基因型分布情況（例）

由表1可見，HCMV gH基因型在不同感染年齡組中分布均無統計學差異（均P＞0.05），均以gH1型多見。

先天性HCMV感染6例，占新診斷ITP患兒的14.6%，其中5例先天性HCMV感染患兒（4例gH1型和1例gH2型）伴神經系統影像學異常，表現為腦室擴張、室管膜下出血、室管膜下囊腫、腦白質信號異常、皮層發育不良等。

2.3 41例不同HCMV gH基因型 ITP患兒臨床表現、治療及預后比較 見表2。

表2 41例不同HCMV gH基因型ITP患兒臨床表現、治療及預后比較（例）

由表2可見，兩組患兒臨床表現差異均無統計學意義（均P＞0.05）。兩組治療措施差異均無統計學意義（均P＞0.05）。gH2組3個月內PLT完全恢復率較gH1組低（P=0.018）；兩組PLT完全恢復時間比較，差異無統計學意義（P=0.804）。

2.4 41例不同HCMV gH基因型ITP患兒實驗室指標比較 見表3。

由表3可見，本研究全部病例均行HCMV IgM測定，陽性率31.7%。4例行pp65測定，陽性比例2/4。34例行血小板抗體檢查均陽性，其中8例血小板抗體≥80%。21例有骨髓涂片報告，包括gH1型13例，gH2型8例，其中13例有巨核細胞增生，13例產板功能異常。gH2型高血小板抗體比例稍高于gH1型，但差異無統計學意義（P=0.228），gH2型骨髓檢查巨核細胞增生比例稍高于gH1型，但差異無統計學意義（P=0.400），兩組各項實驗室檢查及骨髓檢查均無明顯統計學差異。

表3 41例不同HCMV gH基因型ITP患兒實驗室指標比較（例）

3 討論

ITP是一種兒童常見的血液系統疾病，以血小板減少、皮膚黏膜出血為主要表現。原發性ITP定義為單純的免疫系相關的血小板減少，沒有任何明顯發病原因或潛在因素。繼發性ITP指除原發性免疫性血小板減少癥外所有其他免疫性血小板減少癥。兒童ITP的臨床出血癥狀與血小板減少的程度不一致，部分患者僅有血小板減少，沒有出血癥狀，故2009年ITP國際工作組將“特發性血小板減少性紫癜”更名為“免疫性血小板減少癥”。ITP按病程長短分三型：（1）新診斷ITP（newly diagnosed ITP）：病程＜3 個月；（2）持續性 ITP（persistent ITP）：病程 3～12 個月；（3）慢性 ITP（chronic ITP）：病程＞12 個月。本研究以新診斷ITP患兒為研究對象。ITP迄今發病機制尚不十分明確，可能與病毒感染、預防接種、免疫系統疾病、免疫缺陷、結核等相關。目前所知與ITP相關的病原體有十余種，如HCMV、EB病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、水痘病毒、肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、幽門螺桿菌等,其中HCMV感染率較高。

臨床已開展的檢測HCMV活動性感染指標以血清IgM、pp65陽性為主，但是HCMV感染約2周后IgM抗體才能達到能檢測到的水平.此時病原體有可能已被機體免疫反應抑制而處于潛伏感染狀態。嬰幼兒免疫系統發育尚不完善，不能產生足夠的特異性IgM抗體，靈敏度低,易造成假陰性結果[7]。祝興元等[10]研究顯示，血pp65檢測的特異度達100%，但靈敏度只有59.2%。鄭曉群等[7]研究指出，HCMV感染嬰兒與新生兒、幼兒相比，尿液上皮細胞DNA檢測靈敏度更高。當嬰兒尿液上皮細胞DNA拷貝對數值為4.55（即拷貝數3.5×104）時,尿液上皮細胞中HCMV DNA載量對活動性感染診斷的靈敏度和特異度分別為71.4%和75.2%。因此，本研究中嬰兒HCMV活動性感染診斷取尿上皮細胞DNA載量對數≥4.55或血IgM、pp65至少一項陽性。

HCMV包膜糖蛋白基因存在多態性，目前國內外研究較多的如gB、gO、gN等糖蛋白基因和兒童HCMV感染臨床特點的相關[11-13]。gH基因多態性與臨床疾病的關系研究相對較少，Paradowska等[4]研究發現，先天性感染HCMV gH1基因型增加了感覺神經性耳聾風險；研究顯示，嬰兒肺炎、肝炎綜合征、無黃疸型肝炎等疾病中以gH1型感染為主，而ITP患兒以gH2型感染為主[3]。故本研究針對ITP患兒伴HCMV感染的gH基因分型做進一步討論。

本研究ITP伴HCMV感染患兒中年齡＜1歲嬰兒占90.2%，男性所占比例是女性的1.9倍。gH1和gH2兩種基因型以gH1型多見，占63.4%，HCMV感染發病年齡、性別分布無差異?？梢?，兒童HCMV感染相關ITP病例以小嬰兒、男性為主。

HCMV感染按發病時間可分為先天性（＜3周）、圍生期（3周～3個月）、生后感染（≥3個月）。先天性HCMV感染是導致新生兒畸形的主要病因之一，臨床表現為血小板減少、宮內發育延遲、嬰兒肝炎綜合征、小頭畸形、中樞神經系統異常影像學表現（包括腦室增大、顱內鈣化、腦室周圍異?；芈?、皮層或小腦發育畸形），視網膜炎、感音性神經性耳聾等。本研究各組gH基因型分布無統計學差異。

近年來，在研究HCMV進入宿主細胞的機制中發現，HCMV在感染成纖維細胞（FB）和上皮細胞（EC）時是通過不同的進入途徑發生的，這取決于不同的糖蛋白復合物抗原表位。HCMV進入FB時，需要gB和gH/gL/gO組成的糖蛋白復合物相互作用。HCMV進入EC過程中，除了依賴于 gB、gH/gL/gO，還需要由 gH、gL、UL128、UL130和UL131A組成的包膜五聚體復合物（PC）[14]，不同的包膜糖蛋白復合物分布差異，一定程度上決定了HCMV細胞嗜性不同，感染不同的組織細胞，導致臨床表現及預后上的差異。gH是組成包膜糖蛋白復合物gH/gL/gO三聚體、PC的主要構成成分，其基因型的多態性是否可能導致包膜糖蛋白復合物分布不同，影響細胞嗜性尚不明確。本組研究中，ITP患兒出現的皮膚出血、發熱、科室、腹瀉、黃疸、肝腫大等臨床癥狀的差異無統計學意義，gH基因型差異能否導致HCMV對不同組織細胞嗜性不同尚需擴大樣本繼續研究。

HCMV感染相關ITP的致病機制尚不明確，目前公認的是血小板自身抗體的產生，破壞血小板、損害骨髓巨核細胞或減少血小板的產生。也有些研究指出HCMV直接感染巨核細胞導致細胞病變、血小板生成減少[15]。說明部分常規免疫療法無效的ITP可能存在不同的致病機制共同作用。目前對HCMV感染伴ITP患兒是否行抗病毒治療尚有爭議，區別在于以免疫介導效應為主，還是細胞病變效應為主，在治療方案的選擇上可能具有重要的治療意義。從理論上講，免疫介導效應對類固醇、免疫球蛋白治療有反應，細胞病變效應對更昔洛韋治療有反應。然而，在臨床工作中很難區分這些效應。本研究中gH2型感染患兒3個月內血小板恢復率較gH1型低。另外，gH2型呈現高血小板抗體水平的病例較gH1型較高，但均無統計學差異。ITP患兒伴gH2型HCMV感染易出現持續的血小板降低，可能與產生高滴度的血小板抗體有關。gH1型巨核細胞產板功能異常比例較gH2型高，雖統計學無差異，可能提示ITP患兒伴gH1型HCMV感染傾向于影響骨髓巨核細胞功能，破壞產板功能。由于本研究樣本量小，隨訪期短，gH分型對HCMV感染相關ITP臨床表現相關性和預后的確切價值有待日后進行擴大樣本量、延長隨訪期的研究進一步證實。

綜上所述，ITP患兒伴HCMV感染的糖蛋白基因型以gH1型多見。ITP伴gH2型HCMV感染發展為持續性ITP可能性較大。