消化道腫瘤患者與健康人群糞便菌群差異分析

李寧寧，白春梅，趙 林，葛郁平

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院腫瘤內科，北京 100032

消化道腫瘤在世界范圍內的發病率及死亡率均較高[1]，其發生及發展被認為與多種因素相關，如基因或表觀遺傳變異、飲食及環境因素、感染等[2]。腸道是一個復雜的生物系統，腸道內有至少100萬億種微生物，主要包括細菌、古菌、真菌、原生生物和病毒。近年來，腸道菌群被證實與腫瘤等多種疾病相關[3]。腸道菌群在黏膜免疫功能的發展、調節及代謝等方面均有干預作用[4-6]。菌群失調可能通過與人體免疫系統及細胞信號通路之間的作用，促進腫瘤的發生發展[7]。部分種屬的細菌對抗腫瘤治療的療效也有促進或拮抗的作用[8-9]。為了深入了解消化道腫瘤患者與健康人群的腸道菌群差異，本研究采用16S rRNA測序的方法，對42例消化道腫瘤患者、49例健康人的糞便菌群進行分析，旨在探索在消化道腫瘤的發生發展中起關鍵作用的菌群。

對象和方法

對象2018年4月至10月在北京協和醫院腫瘤內科住院的患者42例，其中，食管鱗癌13例，胃或胃食管交界區癌23例，結直腸腺癌6例。入選標準：(1)年齡大于18歲；(2)組織學確診食管鱗癌、胃或胃食管交界區癌、結直腸腺癌；(3)診斷時分期為Ⅳ期或局部晚期；(4)入組前6個月內未接受手術及其他抗腫瘤治療；(5)血常規、肝腎功及合并癥均符合化療、免疫治療要求，無治療禁忌證。排除標準：(1)合并結締組織??；(2)腸梗阻；(3)不符合化療或免疫治療要求的其他情況。對照組為同時期在北京協和醫院體檢中心查體的健康人49人。記錄腫瘤患者入組前1個月內抗生素、腸道益生菌、酸奶等乳酸菌制品的應用情況，并記錄患者臨床信息。記錄對照組健康人的年齡、性別，有腫瘤病史者排除。本研究經北京協和醫院倫理委員會批準，所有入選者均簽署知情同意書。

糞便采集采集健康人群、治療前1周的患者、第1次療效評估患者的糞便，具體為每次取50～100mg中段糞便于MGIEASY樣本采集器中，-80℃保存。

樣本制備及測序采用Qiagen糞便DNA提取試劑盒對糞便樣本進行DNA提取，使用通用引物(515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA；806R：GGACTACHVGGG-TWTCTAAT)擴增16S rDNA V4 區，擴增產物通過Illumina Hiseq2500平臺進行PE250測序。

16S rRNA測序數據分析測序后篩選出優質數據應用軟件FLASH(Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11)[10]，利用重疊關系將成對片段拼接成序列標簽(Tags)；應用軟件USEARCH(v7.0.1090)[11]將Tags聚類后得到可操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)；將OTU序列與數據庫Greengene_2013_5_99[12]比對，進行物種注釋。

根據樣品的OTU及R(v3.1.1)語言繪制Venn圖、進行主成分分析(principal component analysis，PCA)、偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)。Alpha多樣性[12]應用Shannon指數分析并繪制盒形圖、基于Bray-Curtis指數繪制Beta多樣性熱圖[13]、主坐標分析(principal coordinate analysis，PCoA)及聚類圖。參考數據庫16S-Greengene，通過R(v3.1.1)語言，根據物種注釋，繪制Profiling柱狀圖、物種熱圖(Heatmap)分析、物種系統進化樹。

按照腫瘤與健康對照、腫瘤治療前后、是否應用抗生素、是否應用益生菌分組，檢驗菌群豐度。每個物種在各組中的相對豐度，即此物種在這個組所占比例，為此物種測序得到的Tags與這個組所有物種Tags的比值。采用相似性分析(analysis of similarities，ANOSIM)來評估兩組數據的整體相似性及相似性是否顯著：縱坐標表示unifrac 距離的秩；R介于(-1，1)之間，R大于0，說明組間差異顯著；R小于0，說明組內差異大于組間差異，統計分析的可信度用P值表示，P<0.05表示差異有統計學意義。應用LEfSe軟件(Linear discriminant analysis Effect Size)[14]進行組間差異分析，篩選有差異的物種[15]；統計學差異依據P<0.05，采用秩和檢驗。

統計學處理采用R(v3.1.1)語言，兩組間樣品比較使用Wilcoxon秩和檢驗，3組及以上進行比較使用Kruskal-Wallis秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一般情況共有42例腫瘤患者入組，其中，食管癌13例，中位年齡60歲(47～72歲)；男女性別比為5.5∶1；1例(7.7%)使用過抗生素治療；6例(46.2%)服用過益生菌/酸奶；13例均經病理診斷為鱗癌；11例接受過化療，2例接受過PD-1抗體治療。胃癌23例，中位年齡60歲(34～75歲)；男女性別比為2.3∶1；5例(21.7%)使用過抗生素治療；15例(65.2%)服用過益生菌/酸奶；21例經病理診斷為腺癌，1例為印戒細胞癌，1例為神經內分泌癌；22例接受過化療，1例接受過PD-1抗體治療。結直腸癌6例，中位年齡69歲(47～75歲)；男女性別比為1∶1；1例(16.7%)使用過抗生素治療；3例(50.0%)服用過益生菌/酸奶；6例均經病理診斷為腺癌；6例均接受過化療。共有健康對照者49人入組，中位年齡55歲(35～70歲)，男女性別比為1.3∶1。所有90例受試者的糞便標本均可納入菌群分析。

糞便菌群檢測結果35例患者留取2份標本，7例患者僅留取治療前1次標本，對照組49例均留取1次標本，共126份樣本進行糞便菌群測序。采用16S rRNA法，得到5 165 700條Tags。聚類后得到OTU代表序列1008個，進行數據庫比對及物種注釋。結果顯示，所有樣本共檢測到13個門水平的細菌，分別為：放線菌門、擬桿菌門、藍藻門、迷蹤菌門、厚壁菌門、梭桿菌門、黏膠球形菌門、變形菌門、螺旋體門、互養菌門、TM7門、柔膜菌門、疣微菌門。將檢測到的細菌分為18個綱、23個目、38個科、57個屬，最終分離到56個菌株。

腫瘤組與對照組糞便菌群分析不同分組內糞便樣本中菌群的Alpha多樣性好，組間菌落的豐富度均衡，PCoA圖中對照組與腫瘤組散點簇分離，兩組間菌群有分布差異(圖1)。Beta多樣性的相似性分析顯示，對照組與食管癌組(R=0.166，P=0.021)和胃癌組(R=0.241，P=0.002)的組間菌落差異有統計學意義，與結直腸癌組菌群差異無統計學意義(R=0.004，P=0.444)(圖2)。

A.各組別糞便菌群的Alpha多樣性(Shannon指數)盒形圖；B～D：不同組別人群的糞便菌群在3個坐標平面內的Beta多樣性三維PCoA圖(Bray-Curtis)
A.Boxplots of the alpha diversity(Shannon’s diversity scores)of the fecal microbiotas for each group；B-D.3D-PCoA plots(Bray-Curtis distance)of the fecal microbiota community between different groups in three coordinate planes
圖1消化道腫瘤患者與對照組人群的糞便菌群Alpha多樣性盒形圖及Beta多樣性PCoA圖
Fig1Boxplots of the alpha diversity and PCoA plots of the beta diversity of the fecal flora in gastrointestinal tumor groups and control group

A.對照組與食管癌組的比較；B.對照組與胃癌組的比較；C.對照組與結直腸癌組的比較
A.controlvs.esophageal cancer；B.controlvs.gastric cancer；C.controlvs.colorectal cancer
圖2糞便菌群beta多樣性的ANOSIM結果的組間比較
Fig2Results of ANOSIM comparing the beta diversity of fecal flora

在不同細菌分類水平(門、綱、目、科、屬、種)下進行的Heatmap聚類可見，組內樣本間存在相似度，不同組的優勢細菌在各分類水平存在組間差異，圖3A展示了在門水平的相對豐度聚類熱圖。組間差異分析顯示，對照組人群糞便中的放線菌門分類下的紅蝽桿菌科、雙歧桿菌科的細菌豐度較腫瘤組增高；厚壁菌門內的毛螺旋菌科、梭菌科的細菌豐度較腫瘤組增高。進一步線性判別分析(linear Discriminant Analysis，LDA)值分布柱狀圖顯示，以上細菌科分類下的柯林斯氏菌屬、雙歧桿菌屬、瘤胃菌屬、柔嫩梭菌屬、布勞特氏菌屬、羅斯特菌屬、Dorea菌屬在對照組的豐度較腫瘤組顯著增高(圖3 C)。然而腫瘤組的擬桿菌門、變形菌門、梭桿菌門、疣微菌門，豐度較對照組增高(圖3 B)。胃癌組的乳酸桿菌屬豐度最高，通過分析每個樣品的OTUs發現，42例患者中，采樣前補充腸道益生菌者共25例，其中15例屬胃癌組(65.2%)，這些樣本中乳酸桿菌豐度顯著增高。故本研究將乳酸桿菌作為干擾因素，未納入組間差異分析。

通過進一步分析組間差異菌種結果顯示，治療前食管癌、胃癌及結直腸癌組有4個相同的菌種與對照組差異有統計學意義，表現為對照組細菌豐度增高達4.6～49.0倍，這4種菌分別為放線菌門的青春雙歧桿菌(P均<0.01)和短雙歧桿菌(P均<0.001)、厚壁菌門內的普拉梭菌(P均<0.001)和伶俐瘤胃球菌(P均<0.05)。此外，瘤胃球菌屬、柯林斯氏菌屬、Dorea菌屬和布勞特氏菌屬的部分菌種，羅斯特菌屬的、梭菌門下的梭狀梭菌亦在對照組顯示出較不同腫瘤組顯著增高的豐度(P均<0.05)。相反，鏈球菌屬、食物谷菌屬、擬桿菌門的黑色普雷沃菌在部分腫瘤組的豐度較對照組增高(P均<0.05)(表1，圖3 C)。

將35例腫瘤患者接受化療或免疫治療前后的菌群進行對比結果顯示，結直腸癌組治療后未見菌群變化；食管癌組治療后，黑色普雷沃菌豐度增高、Robinsoniellapeoriensis減少。胃癌組治療后黑色普雷沃菌、厚壁菌門下的Shuttleworthiasatelles細菌豐度均降低。

抗生素組與未用抗生素組腫瘤患者糞便菌群差異分析42例患者中，7例患者(胃癌5例、結直腸癌 1例、食管癌1例)在入組前1個月內應用了抗生素?？股貫轭^孢類(5例)及喹諾酮類(2例)。Kruskal-Wallis檢驗發現抗生素組的難辨梭菌(P=0.010)、遲緩埃格特菌(P=0.026)、扭鏈瘤胃球菌(Ruminococcustorques)(P=0.004)豐度較未用抗生素組顯著下降。

補充益生菌組與未補充組患者糞便菌群差異分析25例患者(胃癌15例，食管癌7例，結直腸癌3例)入組前1周內服用了腸道益生菌制劑或酸奶(100～300 g)。Kruskal-Wallis檢驗結果顯示，補充益生菌組患者糞便中的梭狀梭菌豐度升至8倍(P=0.02)、Dorea菌(Doreaformicigenerans)升至4倍(P=0.025)。

討 論

人類的腸道內存在復雜的微生物環境，其中的菌群由50余個菌門、超過500種細菌組成。目前已知人體正常的腸道菌群在門水平接近90%由厚壁菌門和擬桿菌門組成，其余10%由放線菌門、擬桿菌門和梭桿菌門等組成[16]。消化道腫瘤的發病率高，近年來菌群與消化道腫瘤相關性的探索已成為研究熱點。目前，基于腸道菌群的研究主要集中在結直腸癌領域。研究發現，腸道菌群通過一些機制在結直腸癌的發生發展中發揮作用。大腸桿菌[17]和腸球菌[18]表達特異性毒素，誘導DNA損傷，可導致結腸癌。羅斯氏菌[19]通過產丁酸鹽阻斷核因子κB(Nuclear factor kappa beta，NFκB)通路的活化，從而抑制結腸癌變。脆弱擬桿菌[20]誘導免疫微環境中的TH17細胞，可促進腸癌發展。其他消化道腫瘤，如食管癌、胃癌等的探索，極少關注腸道內菌群，更多的研究定位于消化道黏膜菌群或組織菌群方面。據報道，上消化道菌群與食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌的發生發展有關[21]。隨著免疫檢查點抑制劑的應用，近期研究發現，腸道中的部分菌種與肺癌、惡性黑色素瘤人群的免疫治療療效相關[9]，這為腸道菌群在其他腫瘤中的探索提供了新的方向。由于微生物與人體的代謝及免疫系統關系復雜，我們推測腸道菌群可能對消化道不同部位腫瘤的發生發展均有干預作用。這是開展本研究的理論依據。

A.所有糞便樣本菌群在門水平上的相對豐度聚類熱圖，綠色代表相對豐度最大值，紅色代表最小值；B.LEFSe分析的進化分支圖顯示對照組與腫瘤組(治療前)人群的糞便菌群組成有差異；C.LDA值分布柱狀圖顯示對照組人群與治療前各分組腫瘤患者的糞便菌群差異(LDA分數≥ 2，P<0.05)
A.heatmap of relative abundance of bacterial phylum in all the fecal samples：green represents the maximum relative abundance and red the minimum；B.taxonomic cladogram from LEFSe analysis showing differences in fecal taxa between control group and tumor groups before treatment；C.histogram plot of LDA scores for microbiotas in control group compared to tumor groups before treatment(LDA scores≥2，P<0.05)
圖3不同組人群的糞便菌群組成分析圖
Fig3Analysis of fecal microbiota composition in different groups

本研究發現，健康對照組人群的糞便菌群中，兩種雙歧桿菌、普拉梭菌、伶俐瘤胃球菌的豐度較整體腫瘤組增高，與既往研究結果一致[22-23]。這幾種細菌在其他腫瘤相關的研究中也有數據。芝加哥大學的研究發現，腸道中含高豐度雙歧桿菌的惡性黑色素瘤小鼠體內的CD8+T細胞活性更強，接受免疫檢查點抑制劑治療的療效更好[24]。本研究中，對照組普拉梭菌的豐度是腫瘤組的8倍。有研究發現，普拉梭菌[25]與羅斯氏菌均可產生對人體有益的丁酸鹽，兩者在腸癌患者糞便中的含量較健康人群顯著減少[26-27]，推測腸癌的發生可能與產丁酸鹽細菌的減少有關。Feng等[28]研究顯示，健康人群糞便中瘤胃菌屬的豐度顯著高于腸癌患者，與本研究結果一致。在惡性黑色素瘤患者接受免疫檢查點抑制劑治療的研究中，腸道中瘤胃菌屬的豐度亦顯示出與療效呈正相關[29]。盡管以往的數據大多來源于結直腸癌和惡性黑色素瘤，本研究結果仍顯示出不同部位的消化道腫瘤與健康人群之間的腸道菌群差異。食管鱗癌、胃癌、結直腸癌患者腸道中有益菌減少的表現，提示腸道中的關鍵細菌可能與不同部位消化道腫瘤的發生發展有關。

表1 治療前不同分組人群的菌種差異Table 1 Differences in fecal flora in different groups before treatment

a：與對照組相比
a：compared with control group

本研究還發現，除豐度減低的兩種雙歧桿菌、普拉梭菌、伶俐瘤胃球菌外，各腫瘤組分別與對照組存在其他的菌種差異。梭狀梭菌的豐度在對照組顯著高于(2.7倍)食管癌組。厚壁菌門的Dorea菌、羅斯氏菌、甲酸芽殖菌在對照組高于食管癌組，分別達4.0、2.4、3.2倍。對照組柯林斯氏菌豐度亦稍高于食管癌組。相反，食管癌組的食物谷菌屬、鏈球菌、黑色普雷沃菌豐度高于對照組。Yamamura等[30]研究顯示，食管鱗癌組織中可檢測到大量的大腸桿菌、簡要彎曲桿菌，本研究則并未檢測到這2個菌種的差異，提示食管的組織菌群與腸道菌群的組成可能不同，推測與細菌移位時受到消化液、食物、代謝等因素的作用有關。Ohkusa等[31]研究發現，梭狀梭菌具備在炎癥反應早期活化細胞內信號通路的作用，其所屬的梭菌屬亦被發現在腸癌患者糞便中顯著減少[32-33]。本研究中食管癌組該菌種的減少，提示其與食管癌的發生可能有關。一項在18例直腸癌患者對比18例健康人腸道活檢組織菌群的研究顯示，直腸癌患者Dorea菌屬的豐度升高[34]。腸道腺瘤患者亦有此特征[35]。然而本研究結果顯示，Dorea菌在食管癌組的豐度減低，推測可能與樣本來源不同及瘤種差異有關。羅斯氏菌是厚壁菌門的菌種之一。膳食纖維可經羅斯氏菌發酵轉化為以丁酸鹽為主要成分的短鏈脂肪酸，丁酸鹽已被證實可通過阻斷NFκB通路活化，誘導調節T細胞活化，起到抑制結腸癌變的作用。有研究發現，羅斯氏菌菌屬在結直腸癌患者糞便中顯著減少[19,36]。本研究食管癌組該菌的減少與腸癌的報道有相似性。Forbes等[37]研究顯示，食管癌組豐度減低的甲酸芽殖菌在克隆氏病患者中含量也減低?？铝炙故暇趷盒院谏亓龌颊咧械母哓S度與免疫治療療效呈正相關[38]。但兩種菌在消化道腫瘤中均少有研究，本研究中食管癌組的發現值得探索。有數據表明，腸癌患者糞便中普雷沃菌屬較健康人顯著增多[39]。研究顯示，食管癌患者的腫瘤組織中，鏈球菌與普雷沃菌屬的豐度越高，預后越差[40]。但鏈球菌和普雷沃菌屬均缺乏在食管癌患者糞便菌群研究中的數據。兩種細菌在本研究食管癌組中均顯示出較對照組增高的豐度，其意義值得探索。食管癌組豐度增高的食物谷菌屬[41]相關研究較少。與食管癌組相似，本研究中胃癌組的梭狀梭菌及羅斯氏菌較對照組顯著減少，提示上消化道腫瘤的糞便菌群可能存在共同特征。此外，對照組布勞特氏菌屬的2種細菌B.obeum和B.producta豐度較胃癌組增高6～7倍。近年來，胃癌的菌群研究樣本多來源于胃液或胃活檢，腸道菌群研究缺乏。布勞特氏菌屬可產對結腸有益的丁酸鹽[42]。有研究對比了腸道黏膜、糞便及腫瘤組織內菌群，結果發現，腸癌患者的腸黏膜中，布勞特氏菌屬豐度較健康人顯著減低，但糞便及組織菌群中無此差異[43]。本研究則在胃癌患者的糞便菌群中發現此菌顯著減少，為探索該菌屬與消化道腫瘤的相關性提供了更多數據。目前，大部分腸道菌群研究集中在結直腸癌領域。Ahn等[44]研究顯示，與正常人群比較，結直腸癌患者腸道中的擬桿菌門細菌更多(16.2% 比9.9%)，厚壁菌門減少(74.0% 比80.3%)。本研究結果發現，結直腸癌組厚壁菌門內的Dorea菌、布勞特氏菌、瘤胃菌屬、柔嫩菌屬均較對照組減少，與既往研究一致；腸癌組無顯著增多的細菌，推測與樣本量小有關。腸癌組除4種腫瘤組整體減少的細菌外，克林氏菌屬、Dorea菌、甲酸芽殖菌、布勞特氏菌較對照組豐度減低的特征，與食管癌及胃癌組各有相似性。文獻報道較多的羅斯氏菌[19]、核粒梭形桿菌[45]、大腸桿菌[46]在腸癌組與對照組的比較中未得到有統計學差異的結論，考慮與腸癌組樣本量較小有關。

總之，以厚壁菌門，尤其是產丁酸鹽的菌種顯著消耗是消化道腫瘤腸道菌群組成的主要模式，基本與既往結直腸癌相關研究一致。部分已被證實對腸癌等腫瘤的發生發展有干預作用的腸道細菌，也可能與食管鱗癌、胃癌的發病相關。

動物研究發現，5-氟尿嘧啶導致小鼠糞便中厚壁菌門增加，擬桿菌下降[47]；伊立替康可致結腸癌鼠糞便中的厚壁菌門梭菌屬減少[48]。Vbtizou等[49]研究顯示，惡性黑色素瘤患者接受免疫治療后，擬桿菌及變形菌門減少，梭菌屬增加。本研究中，患者接受的抗腫瘤治療主要為以紫杉類、氟尿嘧啶類、鉑類為主的化療，或免疫檢查點抑制劑。結果發現，食管癌及胃癌患者治療后糞便中厚壁菌門部分菌種減少、擬桿菌門黑色普雷沃菌豐度升高，與以往研究有差異。

本研究中患者應用抗生素及益生菌的情況不均衡。應用抗生素組患者的糞便中瘤胃菌屬、梭菌屬、變形菌門顯著減少。既往研究亦發現，應用抗生素后，變形菌在人體糞便菌群中減少[50]。在肺癌及腎癌的研究中，免疫治療后，應用抗生素的患者無進展生存期和總生存期均顯著縮短，推測抗生素可能通過導致腸道菌群失調，降低了免疫治療的療效[9]。本研究結果初步顯示出抗生素對消化道腫瘤患者腸道菌群的影響，仍需隨訪其抗腫瘤治療的療效及預后。補充益生菌組患者糞便中梭菌、乳酸桿菌及Dorea菌豐度升高數倍，結合既往研究，這3種菌可能對腸道有保護作用。大量研究顯示，補充益生菌可以更好地協助機體建立健康的菌群，在腫瘤患者中補充有益菌也許可起到增強免疫治療療效的作用[9]。

本研究還發現，食管癌及胃癌患者的腸道菌群中亦存在與健康人群有顯著差異的標志性菌群，主要集中在厚壁菌門及放線菌門，與結直腸癌有一致性，提示這些細菌與上消化道腫瘤的發生發展可能有關。此外，本研究結果顯示，將更無創簡便的糞便菌群分析的方法應用于上消化道腫瘤領域可行。本研究鑒定出文獻報道較少的菌種，有擴大樣本量并進行代謝及功能學分析的意義?？股睾鸵嫔鷮θ梭w腸道微環境的影響已成為研究熱點，希望本研究可為此類探索提供更多的數據。

本研究存在以下局限性：(1)腸道菌群的組成及功能復雜，結果可能受到飲食、代謝等影響，造成數據的偏倚。(2)樣本量較小，部分差異無統計學意義，需進一步擴大樣本量。綜上，腸道細菌通過其代謝和對免疫功能的影響發揮作用，本研究進行了菌群的鑒定及豐度測定，尚未完成功能學研究。今后擬定以菌群分析為基礎，進一步擴大樣本量探討細菌與消化道腫瘤治療療效的關系，并進行細菌的代謝通路研究。