微小RNA-133b對心肌纖維化的影響

張松林，范粉靈，魏 峰，王 軍，張玉順

西安交通大學第一附屬醫院結構性心臟病科，西安710061

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是由反復或持續性心肌缺血引起的結果，主要表現為纖維結締組織增多、彈性變差、實質細胞減少，最終導致心肌結構破壞、功能衰竭[1]。微小RNA(microRNA，miRs)是一類大小約為18～25個核苷酸的RNA，其作用機制為通過促進靶基因mRNA的降解或者抑制靶基因的翻譯來抑制靶分子的表達。研究表明，miRs與心肌梗死后MF心室重構相關[2-4]。Zhang等[5]研究發現，miR-29參與了MF過程，過表達miR-29后，MF過程被抑制，而敲低miR-29后，MF相關蛋白表達上升，說明miR-29可抑制MF進程。Thum等[6]研究顯示，miR-21可通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路調控心肌細胞間質纖維化。此外，多種miRs，如：miR-133a[7]、miR-503[8]、miR-101[9]和miR-29[5，10]被證實能夠影響心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFs)的生理功能進而發揮抗纖維化作用。miR-133b是與miR-133a同家族的miR，有研究表明miR-133a可抑制心肌纖維化，但是對于miR-133b與心肌纖維化的調控關系尚不明確，以往對miR-133b的研究主要集中于腫瘤，在MF過程中的研究鮮有報道。本研究探索了miR-133b對MF的影響，以期為探尋新型治療和干預MF的靶分子提供理論依據。

材料和方法

材料CFs由中國科學院上海細胞庫提供。RPMll640培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司，miR-133b mimic及miR-133b inhibitor均購自廣州銳博公司，X-treme GENE siRNA轉染試劑購自瑞士羅氏公司，CCK8檢測試劑盒由日本同仁化學研究所提供，結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、collagenⅠ、collagen Ⅲ、α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)及β-actin抗體購自美國Cell signaling公司。

人CFs細胞培養采用含100 ml/L胎牛血清的RPMI 1640培養基，于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。

細胞轉染將細胞以2×105個/孔接種于6孔板中，24 h后細胞融合度達30%～40%。配制轉染試劑混合液：A(每孔)：轉染試劑5 μl+無血清無雙抗RPMI 1640 100 μl。B(每孔)：miR-133b mimic(miR-133b inhibitor)或control mimic(control inhibitor)7.5 μl(20 μmol/L)+無血清無雙抗RPMI 1640 100 μl。室溫靜置5 min后混合A、B兩種試劑，室溫靜置20 min為C液。棄去細胞原培養液，加入C液200 μl及含10%血清的RPMI 1640培養基1.3 ml，輕晃混勻后置于37℃、50 ml/L CO2培養箱中培養，轉染48 h后提取mRNA，轉染72 h后提取蛋白，進行后續實驗。

CCK8法檢測細胞增殖取對數生長期細胞，消化后離心，細胞收集后用含100 ml/L胎牛血清的RPMI1640重懸，反復吹打，制成單細胞溶液，以每孔1000個細胞接種于96孔板中，每組設置3個復孔，置于37℃、50 ml/L CO2培養箱中培養21、45、69、93、117 h后，加入10 μl CCK8于每孔細胞中，繼續培養3 h后測定吸光度值。

Western blot檢測提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，制好膠后，每個泳道以30μg蛋白上樣，60V恒壓電泳至樣品跑齊成1條直線，90V恒壓電泳至樣品中的溴酚藍到達濃縮膠和分離膠的分界線處，將電壓調至120V繼續電泳達到膠底部，轉膜完成后將NC膜取出，根據目的蛋白和內參蛋白的相對分子質量大小將NC膜裁剪成條狀，標記后浸泡于封閉液中，室溫下脫色搖床上封閉1 h；將NC膜置于抗體孵育盒中，加入適量相應一抗，4℃過夜；TBST洗膜5次，每次8 min；用封閉稀釋液稀釋二抗；將NC膜置于抗體孵育盒中，加入適量相應二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜8 min×5次。加入發光試劑ECL曝光。

qRT-PCR提取RNA，采用美國Thermo公司的反轉錄試劑盒行進RNA反轉錄。將引物干粉稀釋成10 μmol/L的工作濃度，以反轉錄所得cDNA為模板，按下述體系配制實時定量PCR反應液：SYBY Green 10 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，cDNA模板2.0 μl，ddH2O 7.2 μl；反應條件：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s，72℃ 30s，共40個循環。每次實驗均設未加模板的陰性對照組，每個樣品設置3個復孔，重復實驗3次，采用2-ΔΔCt方法計算相對表達量(relative quantity，RQ)，比較每組之間的基因表達差異。

雙熒光素酶報告實驗構建含有CTGF mRNA的3’UTR(WT)及其3’UTR突變體(MUT)的雙熒光報告基因系統。方法是針對CTGF 3’UTR預測結合miR-133b區域，設計PCR引物，將PCR產物連在骨架質粒pMIR REPORT Luciferase中，導入感受態細胞后搖菌，進行克隆篩選后送北京華大公司基因測序，結果經比對正確后再搖菌小提得到目的質粒。在CFs中共轉染miR-133b mimic、WT及pRL-TK(內參質粒)，轉miR-133b mimic control、WT及pRL-TK(內參質粒)作為對照，24 h后采用檢測試劑盒檢測。對確認有效的CTGF 3’UTR區域，利用重疊PCR原理設計引物制造結合區域點突變，余過程如上。

統計學處理采用SPSS 22.0統計軟件，符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本雙側t檢驗；組間構成比比較采用χ2檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

瞬時轉染miR-133b mimic及miR-133b inhibitor后miR-133b的表達變化在CFs轉染miR-133b mimic或inhibitor 48 h后提取RNA，實時定量PCR檢測結果顯示，轉染miR-133b mimic后miR-133b的表達水平明顯高于陰性對照組(1比1.46×105；t=26.219，P=0.000)，轉染miR-133b inhibitor后miR-133b的表達水平明顯低于陰性對照組(1比0.42；t=6.738，P=0.003)。

miR-133b抑制CFs增殖轉染CFs 21、45、69、93和117 h后，與陰性對照組相比，miR-133b mimic組CFs增殖能力明顯降低，而miR-133b inhibitor組CFs增殖水平明顯上升(P均<0.05)(圖1)。

miR-133b對CFs中CTGF、collagenⅠ、collagen Ⅲ和α-SMA的表達水平影響與陰性對照組相比，過表達miR-133b后，CTGF(t=9.213，P=0.001；t=8.195，P=0.001)、α-SMA(t=6.511，P=0.003；t=4.434，P=0.011)、collagenⅠ(t=3.172，P=0.034；t=4.053，P=0.015)及collagen Ⅲ(t=6.404，P=0.003；t=5.319，P=0.006)的mRNA和蛋白表達水平均明顯下調；敲低miR-133b后，CTGF(t=9.439，P=0.001；t=14.100，P=0.000)、α-SMA(t=4.519，P=0.011；t=4.377，P=0.012)、collagenⅠ(t=5.966，P=0.004；t=5.514，P=0.005)及collagen Ⅲ(t=4.622，P=0.010；t=4.996，P=0.008)的mRNA和蛋白表達水平均明顯上升(圖2)。

CTGF為miR-133b的靶基因將miR-133b mimic或mimic control與WT 3’UTR表達載體或MUT 3’UTR表達載體以及海腎熒光素酶表達載體共轉染CFs，檢測并比較不同實驗組熒光素酶的相對活性，結果顯示，共轉染miR-133b mimic和WT 3’UTR表達載體細胞的相對熒光素酶活性明顯低于共轉染mimic control和WT 3’UTR表達載體的細胞(t=5.654，P=0.005)，共轉染miR-133b mimic和MUT 3’UTR表達載體細胞的相對熒光素酶活性與共轉染mimic control和MUT 3’UTR表達載體的細胞差異無統計學意義(t=0.380，P=0.724)(圖3)。

CFs：心肌成纖維細胞
CFs：cardiac fibroblasts
A.過表達miR-133b抑制CFs增殖；B.敲低miR-133b促進CFs增殖
A.miR-133b overexpression inhibited proliferation of CFs；B knockdown of miR-133b promoted proliferation of CFs
圖1miR-133b對CFs增殖的影響
Fig1Effect of miR-133b on the proliferation of CFs

CTGF：結締組織生長因子；α-SMA：α平滑肌肌動蛋白
CTGF：connective tissue growth factor；α-SMA：α-smooth muscle actin
A.mRNA水平；B.蛋白水平
A.mRNA level；B.protein level
圖2miR-133b對纖維化相關指標的影響
Fig2Effect of miR-133b on fibrosis-related indicators

討 論

MF是心肌組織重構的表現之一，是由反復或持續性心肌缺血導致的。因此，許多心血管疾病，如心肌梗死、心力衰竭等的基礎病變之一即為MF。深入了解心肌纖維化的發生機制，明確其進程中的關鍵分子可能為抑制MF，逆轉心臟重構的精準治療提供新的靶點。CFs是纖維化時細胞外基質重要的來源細胞，當CFs被激活增殖，細胞外基質合成分泌增加，進一步促進了纖維化。因此，抑制CFs活化增殖是抑制MF的關鍵點[11]。本研究結果顯示，過表達miR-133b可以抑制CFs增殖，提示miR-133b可能參與了MF的過程。

CTGF又名CNN2，是基質細胞蛋白家族成員，由349個氨基酸組成，相對分子質量為34 000～38 000，是一種富含半胱氨酸的分泌肽。在正常心肌組織中，CTGF主要存在于內皮細胞；在多種誘因所致的心肌纖維化中，CTGF在成纖維細胞中表達上調[5]。在心肌組織受損后出現，許多平滑肌細胞標記物在心肌成纖維細胞中表達升高，如α-SMA，其聚集于應力纖維可以通過細胞表面特殊的黏附因子改變細胞外基質的結構[3]。Ⅰ、Ⅲ型膠原是構成心肌膠原網絡的主要成分，膠原纖維的數量、分布及排列發生改變均可導致纖維化的發生，是心肌纖維化的物質基礎[3]。本研究結果顯示，過表達miR-133b可以抑制CFs中的CTGF、collagenⅠ、collagen Ⅲ和α-SMA水平，而抑制miR-133b可以增加CFs中的CTGF、collagenⅠ、collagen Ⅲ和α-SMA水平，提示miR-133b可抑制心肌纖維化過程。

WT：野生型CTGF3’UTR表達載體；MUT：突變型CTGF 3’UTR表達載體
WT：wild-type CTGF 3’UTR expression vector；MUT：mutant CTGF 3’UTR expression vector
圖3miR-133b靶向抑制CTGF
Fig3miR-133b targeted CTGF

研究顯示，CTGF作為轉化生長因子β下游分子在MF中起重要作用，發生MF時，CTGF的表達水平明顯上調。本研究采用生物學軟件分析CTGF的3’UTR區存在miR-133b結合的“種子區域”，結果發現CTGF為miR-133b的靶基因，雙熒光素酶報告實驗也證實了miR-133b可靶向抑制CTGF的表達。

綜上，本研究結果顯示，過表達miR-133b可抑制CFs增殖，并下調纖維化指標CTGF、α-SMA、collagenⅠ、collagen Ⅲ的mRNA及蛋白表達水平，反之亦然，且CTGF為miR-133b的靶基因。提示miR-133b可能是通過靶向抑制CTGF來影響CFs的活化增殖，從而改善心肌纖維化。