甘蔗亞硫酸法養莖雜交影響因素分析

雷敬超， 周 會， 高麗花， 楊翠芳， 周 珊， 張保青， 王澤平， 楊榮仲， 李 翔， 高軼靜

(1.廣西農業科學院甘蔗研究所/廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室/ 農業農村部廣西甘蔗生物技術與遺傳改良重點實驗室， 南寧 530007)

目前，通過選配甘蔗親本進行授粉雜交仍是甘蔗育種的主要方式，而甘蔗亞硫酸法養莖雜交是保證在一定時間內蔗莖進行新陳代謝、完成開花結實的一項重要技術。該方法節省大量人力，不浪費花穗，特別是錯過包莖時間的親本，而且便于集中管理，雜交效果好，大大提高了花穗的生產效率。因此，研究該方法養莖雜交過程中穗莖節數和溶液更換周期對開花結實的影響，可為甘蔗亞硫酸法養莖雜交中開花親本的保存、生長提供參考依據。甘蔗亞硫酸養莖雜交法最早由美國的Verret等[1]提出，然后經由各國甘蔗育種工作者不斷改進并利用。在我國，最早由海南甘蔗育種場的陳西文[2]對亞硫酸法的水質、配方、雜交期間的溫度和濕度進行了研究，之后，云南農科院甘蔗所的王麗萍[3]對傳統的高壓包莖法和亞硫酸養莖法進行了比較，陳玉水等[4-5]在描述臺灣糖業研究所對甘蔗種子發芽力影響因素的研究中，也應用高壓包莖法和亞硫酸養莖法進行了比較。研究結果均表明，甘蔗亞硫酸養莖雜交能提高種子的飽滿度和有效花穗率，值得進一步研究利用。甘蔗亞硫酸法作為甘蔗開花雜交的一項重要技術，除了配方的改良、雜交期間的溫度和濕度外，對該方法的其它影響因素研究未見相關報道。因此，本研究選取2個易開花的優良親本作為試驗材料，試驗地點設在中國農業科學院甘蔗研究中心海南甘蔗雜交基地，設置不同的穗莖節數和亞硫酸溶液養莖更換周期，對各處理的自交發芽率進行統計分析。確定最佳的穗莖節數和亞硫酸溶液更換周期，以期在甘蔗選育種的雜交過程中應用亞硫酸法為開花親本的保存、生長提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的2份甘蔗親本為易開花的優良親本桂糖44號和云野06-9。其中桂糖44號(桂糖的英文代碼用GT表示)為廣西壯族自治區農業科學院甘蔗研究所選育，桂糖系列品種均具有早熟、高糖、豐產、宿根性好的特點[6-8]；云野06-9是割手密BC4材料(云野的英文代碼用YunY表示)，主要具有早熟的特點，為云南省農業科學院甘蔗研究所惠贈。試驗地點設在中國農業科學院甘蔗研究中心海南甘蔗雜交基地，砍取甘蔗穗莖的時間為2018年11月23日。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設計

2個開花親本的穗莖節數分別選取15節、20節、25節(穗莖節數從花穗下第1片葉開始計算，第15葉位對應的節定義為第15節)，各設置3 d、5 d、7 d的亞硫酸溶液養莖更換周期，每個處理3次重復。每個處理分別置于亞硫酸溶液中養莖自交，40 d后對收集各處理的種子進行發芽試驗，統計各處理的克平均發芽數。

1.2.2抽穗率調查

記錄供試親本的開花株數和總有效株數，統計供試親本抽穗率，抽穗率(%)=(抽穗株數/總株數)×100%。

1.2.3花粉染色率測定

花粉染色率的測定采用碘-碘化鉀染色法[8]。在顯微鏡下觀察視野中，呈球形且被染成藍褐色的花粉粒為可能具有活性的花粉，而呈三角形或皺縮且未被染色或染色很淺的花粉粒則為未發育或發育不全的無活性花粉?；ǚ哿亢腿旧什捎?位數數值表示方法，該方法從澳大利亞甘蔗產業研究所(SugarResearchAustralia，SRA)引進：估算觀察視野中花粉量占總視野面積的比例，比例低于50%時百位數用1表示，超過50%時百位數用2表示；十位和個位數表示花粉染色率。染色率(%)=(視野中被染色的花粉粒數/視野中總花粉粒數)×100%。

1.2.4亞硫酸法養莖雜交

選擇開花長勢一致的抽穗莖，從根部截斷，剪除大部分葉片，運回溫室，按試驗設計的節數，快速切去穗莖下端節間組織，迅速插入盛有18 L亞硫酸溶液的桶中。每日08：00時和10：00時進行人工授粉，搖動花穗，使花粉飄落至花穗上，人工授粉過程持續7 d。雜交溫室內控制溫度在25～28 ℃，相對濕度在60%～85%。亞硫酸養莖溶液配方為每升水溶液含：亞硫酸(以SO2計)154.5 mg，硫酸39.1 mg，硝酸54.6 mg，磷酸89.8 mg。

1.2.5發芽試驗

雜交完畢15 d左右，用特制沙袋套住整個花穗，下端扎緊；35 d后，剪下花穗，放入烘干房間(溫度11 ℃，濕度13%)進行干燥處理4 d，然后脫粒，裝入防水紙袋中。稱取約0.5 g，每個處理3次重復，置于鋪有濾紙的培養皿中，平鋪種子，噴水，濕潤種子和濾紙，再放置于光照培養箱(32 ℃，12 h暗期，12 h光照)中培養5 d，然后統計發芽數量?？似骄l芽數=種子發芽數/種子重量(g)。

1.3 數據分析

應用R語言ggplot 2軟件包進行差異顯著性分析，應用Microsoft Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 甘蔗親本的開花習性

桂糖44號和云野06-9的抽穗率分別為40%和50%，均屬易開花親本，可為該試驗設計的多個處理提供足夠的穗莖(表1)。桂糖44號和云野06-9的花粉量和花粉染色率均為255%，說明該2個親本花粉量中等(百位數為2)，染色率約為55%，保證了供試材料進行自交的花粉量和花粉活性(表1，圖1，圖2)。

表1 甘蔗親本的開花習性

親本抽穗率/%花粉量及平均染色率/%開花特點桂糖44號40255先抽后開云野06-950255邊抽邊開

注：用3位數數值組合來表示花粉量和染色率，百位數代表花粉量，1表示少，2表示多；十位和個位數以百分數形式表示染色率。

圖1 桂糖44號花粉鏡檢觀察

圖2 云野06-9花粉鏡檢觀察

2.2 穗莖節數和溶液更換周期對亞硫酸法養莖雜交的影響

差異顯著性分析表明，穗莖節數和亞硫酸溶液養莖更換周期對親本開花結實的影響沒有顯著差異。在本試驗中，穗莖節數為15節時，2個親本的克平均發芽數均隨著亞硫酸溶液更換周期天數的增加而增加，并且在更換周期為7 d時的克平均發芽數為所有組合處理中最高；穗莖節數為20節時，桂糖44號在各個亞硫酸溶液更換周期組合處理中的克平均發芽數無明顯差異，云野06-9在亞硫酸溶液更換周期為5 d的組合處理中克平均發芽數最低；穗莖節數為25節時，桂糖44號在亞硫酸溶液更換周期為5 d的組合處理中克平均發芽數最低，云野06-9在各個亞硫酸溶液更換周期組合處理中的克平均發芽數無明顯差異(圖3)。

圖3 穗莖節數和亞硫酸溶液更換周期對 親本養莖雜交的影響

3 討 論

本研究選擇的2個親本花粉量和染色率都較高，然而自交后的克平均發芽數都較低(不超過30)，這與前人所述的甘蔗自交結實率很低[9]的結果一致，但是整體偏低的發芽數數據導致各處理間的差異幅度不能更大程度地顯現。在后續的甘蔗亞硫酸法養莖雜交影響因素試驗中，可考慮用供試親本作為父本與同一個母本雜交，提高結實率。

亞硫酸溶液養莖雜交的原理是亞硫酸溶液中的二氧化硫作為防腐劑，不僅可抑制微生物的生長，還具有還原作用，可防止主體被氧化。本研究的亞硫酸溶液更換周期從3 d至7 d均未對親本的開花結實具有顯著影響，說明在本試驗條件下(溫度25～28 ℃，濕度60%～85%)，即使亞硫酸溶液中的二氧化硫有所揮發，但其初始濃度(154.5 mg·L-1)足夠維持親本在7 d內的生長。

本研究結果顯示，穗莖節數和亞硫酸溶液養莖更換周期對親本開花結實的影響沒有顯著差異，并且穗莖節數為15節、亞硫酸溶液養莖更換周期為7 d的組合處理的發芽效果最好，說明不僅在砍取穗莖時可選擇較短的長度(15節)，為穗莖的運輸帶來便利，并且在養莖雜交過程中也不需要頻繁更換溶液，節約了人工和成本。

4 結 論

穗莖節數和亞硫酸溶液養莖更換周期對親本開花結實的影響沒有顯著差異，在砍取穗莖時可選擇較短的長度，在養莖雜交過程中也不需要頻繁更換溶液，節約了人工和成本。