山東省小麥莖基腐病的病原鑒定

孟程程,孫曉鳳,張 莉,閆佩瑤,于金鳳

山東省小麥莖基腐病的病原鑒定

孟程程,孫曉鳳*,張 莉,閆佩瑤,于金鳳**

山東農業大學 植物保護學院, 山東 泰安 271018

為明確山東小麥莖基腐病的病原組成及優勢菌群，本研究自山東省濟南、泰安、德州、濰坊、煙臺、聊城、菏澤、臨沂等8個地區，共采集200余份小麥莖基腐病發病樣本，分離獲得224個菌株，從中選取190個代表性菌株，對其EF-1α序列進行分析，鑒定其所屬類群并測定不同病原菌的致病性。結果表明：190個菌株中包含142株假禾谷鐮孢菌（）、35株禾谷鐮孢菌()、6株輪枝鐮孢菌()和7株層出鐮孢菌()，假禾谷鐮孢菌占鑒定菌株的74.7%，是山東省小麥莖基腐病的優勢病原菌。致病性測定結果表明，分離得到的不同種鐮孢菌均對小麥植株具有致病力，但假禾谷鐮孢菌致病力最強。

小麥莖基腐病; 病原菌; 假禾谷鐮孢菌; 致病性

小麥莖基腐?。╓heat Crown Rot）是一種典型的土傳性真菌病害，該病害最早報道于澳大利亞[1]，之后在亞洲[2-6]、非洲[7]、北美洲[8,9]、南美洲[10]以及大洋洲[11]等世界各小麥產區均有發生報道。該病害在小麥生長全期均可發生，播種期侵染造成小麥爛種；苗期侵染使小麥莖基部腐爛，發病后期嚴重時導致小麥枯白穗，造成減產甚至絕產[12]。

近年來，我國各地小麥莖基腐病發生頻繁，山東省小麥莖基腐病的發生也呈加重趨勢。病原菌鑒定對病害的防控十分重要，目前尚無對山東省小麥莖基腐病病原菌的系統報道。本試驗對山東省8個地區的小麥莖基腐病病菌進行了分離鑒定，采集地基本涵蓋了不同小麥種植區，分離鑒定結果比較客觀地反映了小麥莖基腐病病原菌的組成，對山東省小麥莖基腐病的防治有一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集小麥莖基腐病樣本采集自山東省濟南、德州、聊城、菏澤、泰安、濰坊、煙臺、臨沂等8個地區。

1.1.2 培養基 PDA培養基，用于病原菌的分離純化；CMC培養基，用于病原菌分生孢子的培養。

1.2 病原菌的分離

取病株莖基部發病部位剪成約0.5 cm的片段，0.1%升汞浸泡30 s，75%酒精浸泡30 s，無菌水漂洗3次，滅菌濾紙吸干表面水分后置于PDA培養基中，光照培養箱中25 ℃培養，挑取新生菌落邊緣菌絲繼續純化培養，結合《常見鐮刀菌鑒定指南》[13]將具有鐮孢菌形態特征的菌株進行保存。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 病原菌的形態學鑒定將純化的病原菌接種到PDA培養基上，在智能光照培養箱中25 ℃培養5~7 d，觀察菌落形態和色素產生情況；接種病原菌到100 mL CMC培養基中，25 ℃、160 rpm培養3 d，采用顯微鏡(尼康90i)觀察分生孢子及分生孢子梗形態。結合《常見鐮刀菌鑒定指南》對不同病原菌進行形態學鑒定。

1.3.2 病原菌的分子生物學鑒定EF-1α基因對于鐮孢菌種級水平的區分鑒定具有有效性[14]，本研究采用CTAB法[15]提取供測菌株的基因組DNA。使用EF-1α基因序列特異性引物EF-1T(5′-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3′)，EF-2T(5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′)進行PCR擴增[16]。PCR反應體系為：DNA模板2 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、10×EsayTaq 5 μL、dNTPs 4 μL、EasyTaq DNA Polymerase 1 μL，加ddH2O至50 μL。擴增條件：94 ℃ 90 s，92 ℃ 30 s，55 ℃ 90 s，72 ℃ 90 s，72 ℃ 3 min。擴增產物采用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測并送上海博尚生物科技有限公司進行測序。測序結果在NCBI中進行BLAST比對。

1.4 病原菌的系統進化分析

依據測序結果，選取不同種鐮孢菌的代表菌株，使用MEGA5.1以鄰接法構建系統進化樹。

1.5 病原菌的致病性測定

1.5.1 帶菌麥粒培養基的制備選取飽滿麥粒沸水煮至微微開裂，轉移至錐形瓶中高溫蒸汽滅菌，隨機選取不同種鐮孢菌菌株接種滅菌麥粒，菌株編號分別為假禾谷鐮孢菌WHF104、禾谷鐮孢菌WHF57、輪枝鐮孢菌WHF203和層出鐮孢菌WHF149，25 ℃培養至菌絲布滿錐形瓶，取出帶菌麥粒晾干備用。

1.5.2 病原菌的接種溫室盆栽條件下，以濟麥22為試驗材料，無菌水浸泡24 h催芽，將萌發麥粒與帶菌麥粒培養基一齊播種至育苗盆中，帶菌麥粒位于萌發種子下方1 cm處。共設置4個重復，每個重復播種5個麥粒，以不接種帶菌麥粒的小麥植株作為對照。

1.5.3 病情指數的計算接種30 d后對小麥植株發病情況調查，室內盆栽小麥莖基腐病的分級標準為：0級：整株無變褐癥狀；1級：植株僅第一葉鞘變褐，且變褐面積不超過1/2；3級：植株僅第一葉鞘變褐，且變褐面積超過1/2；5級：植株第二葉鞘變褐；7級：植株第三葉鞘變褐或植株死亡。

統計不同處理小麥莖基腐病發病級數并計算病情指數。利用DPS2000軟件進行差異顯著性分析。

病情指數=100×Σ（各級發病個數×各級代表值）/（調查總個數×最高級代表值）

2 結果與分析

2.1 小麥莖基腐病病原的分子鑒定

從采集的小麥莖基腐病樣本中，共分離得到224個小麥莖基腐病菌株，并編號（見表1）。

表1 小麥莖基腐病病原菌的分離

根據菌落特征，選取190個代表菌株對其EF-1α基因進行特異性擴增，獲得約710 bp大小的片段（見圖1）。擴增產物送上海博尚生物技術服務有限公司進行測序。將測序結果在Gen Bank中進行序列比對，鑒定其所屬種群（見表2）。

結果表明，190個菌株中有142株假禾谷鐮孢菌、35株禾谷鐮孢菌、6株輪枝鐮孢菌及7株層出鐮孢菌。假禾谷鐮孢菌占總體74.74%，為優勢病原菌。不同地區均以假禾谷鐮孢菌為主要病原菌。從不同種鐮孢菌中隨機選取27個代表菌株，使用MEGA5.1構建系統進化樹(圖2)。

圖2 基于EF-1α基因構建的系統發育樹

由圖2可以看出，假禾谷鐮孢菌與禾谷鐮孢菌之間親緣關系較近，層出鐮孢菌和輪枝鐮孢菌之間種間親緣關系較近；同種鐮孢菌的不同菌株也存在分支，這些分支與地理來源無明顯聯系，4種鐮孢菌均存在較明顯的遺傳分化現象，遺傳多樣性豐富。

2.2 小麥莖基腐病病原菌的形態特征

為進一步獲得不同鐮孢菌的形態學特征，將4種鐮孢菌分別接種到PDA培養基和CMC培養基中，觀察不同種鐮孢菌的菌落形態、分生孢子和分生孢子梗形態（見圖3）。

圖3 四種鐮孢菌的菌落形態、分生孢子及分生孢子梗形態

注：A，E為假禾谷鐮孢菌菌落形態及分生孢子、分生孢子梗；B，F為禾谷鐮孢菌菌落形態及分生孢子、分生孢子梗；C，G為輪枝鐮孢菌菌落形態及分生孢子、分生孢子梗；D，H為層出鐮孢菌菌落形態及分生孢子、分生孢子梗。Bar=10 μm。

Note: These pictures showed that colony morphology, conidium and conidiophore in fourspp., A, E belong to; B, F belong to; C, G areand D, H are. Bar=10 μm.

如圖3所示，不同鐮孢菌菌落形態區別較為明顯，假禾谷鐮孢菌菌絲直立致密呈白色，中心菌絲為黃色，產紅色，黃色色素或不產色素，分生孢子多為大型分生孢子，鐮刀型，隔膜3~5個；禾谷鐮孢菌菌絲白色或黃色，產玫紅色或黃色色素，分生孢子多為大型分生孢子，鐮刀型，與假禾谷鐮孢菌不易區分，隔膜3~5個；輪枝鐮孢菌菌絲呈卷曲狀，中心菌絲為紫色，邊緣菌絲呈白色，產紫色色素，多為大型分生孢子，隔膜2~4個；層出鐮孢菌菌絲致密卷曲，產紫色、粉色色素或不產色素，分生孢子多為小型分生孢子，單隔或無隔。除假禾谷鐮孢菌外，其他3種鐮孢菌形態學特征符合《常見鐮刀菌鑒定指南》描述，假禾谷鐮孢菌與禾谷鐮孢菌在形態特征上比較相似，需輔助于分子生物學方法進行鑒定。

2.3 病原菌致病性的測定

以濟麥22為試驗材料，測定不同種鐮孢菌對小麥植株的致病性（見表3）。

表3 不同鐮孢菌對小麥苗期植株的致病性測定

注：病情指數中字母相同表示差異未達顯著水平(>0.05)，字母不同表示差異達顯著水平(<0.05)。

Note: The same alphabets of disease index list shows no significance (>0.05), on the contrary, having significance (<0.05).

結果表明，不同種鐮孢菌對小麥植株均具有致病力，可引起小麥莖基腐病的典型癥狀，且致病力差異顯著。假禾谷鐮孢菌致病力最強，接種小麥植株發生死苗，病情指數為100。禾谷鐮孢菌、輪枝鐮孢菌和層出鐮孢菌病情指數分別為68.6、44.3和25.7。

將接種發病的小麥植株經表面消毒后，重新在PDA平板上進行病菌的分離，均僅分離到了對應的接種病菌，說明分離到的4種鐮孢菌均為小麥莖基腐病的致病菌。

3 討 論

本試驗自山東省濟南、德州、聊城、菏澤、泰安、濰坊、煙臺、臨沂等8個地區采集小麥莖基腐病樣本200余份，分離得到224個鐮孢菌菌株，經鑒定包括、、和，其中假禾谷鐮孢菌占74.74%，為優勢病原菌，該鑒定結果與澳大利亞、美國、及中國大部分地區小麥莖基腐病病原的鑒定結果基本一致[5,6,8,10]，但與李偉、張向向等人的鑒定結果存在差異，他們在對安徽、江蘇、河南、湖北、四川、河北等地小麥莖基腐病的病原鑒定中，認為小麥莖基腐病的主要病原菌是禾谷鐮孢菌[2,3]。這種差異可能與采集地區及田間氣候有關，周海峰對黃淮麥區小麥莖基腐病病原的鑒定結果表明，河南北部以假禾谷鐮孢菌為主，中東部則是禾谷鐮孢菌和假禾谷鐮孢菌混合發生區，江蘇及安徽北部以禾谷鐮孢菌分離頻率最高[4]。

不同鐮孢菌對小麥植株的致病性測定結果表明，、、和對小麥植株均具有致病力，且致病力差異顯著，測定結果與吳斌等人的測定結果基本一致[5]。假禾谷鐮孢菌致病力最高，病情指數為100，對小麥植株的高致病力可能是其成為山東地區小麥莖基腐病優勢致病菌的一個重要原因。

本試驗明確了山東省小麥莖基腐病的主要致病菌是以假禾谷鐮孢菌為主的鐮孢菌屬真菌，為山東省小麥莖基腐病的綜合防治奠定了病原學基礎，具有一定的實踐應用價值。

4 結 論

（1）山東省小麥莖基腐病的病原鑒定。山東省小麥莖基腐病病原菌包括假禾谷鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、輪枝鐮孢菌和層出鐮孢菌。假禾谷鐮孢菌為優勢病原菌；

（2）不同病原菌的致病性測定。不同病原菌對小麥植株均具有致病性，且致病力差異顯著。假禾谷鐮孢菌致病力最高。

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Pathogen Identification for Wheat Crown Rot in Shandong Province

MENG Cheng-cheng, SUN Xiao-feng*, ZHANG Li, YAN Pei-yao, YU Jin-feng**

College of plant protection/Shandong Agricultural University, Tai’an271018, China

In order to clarify the pathogens composition and dominant species of wheat crown rot in Shandong wheat growing regions, A total of more than 200 samples of wheat stem rot from Jinan, Taian, Dezhou, Weifang, Yantai, Liaocheng, Heze and Linyi was colected, isolated 224 strains, and selected 190 representative strains to analyze their EF-1α sequences and identify the group to which it belongs and determine the pathogenicity of different pathogens. The results showed that among the 190 strains, there are 142 of, 35 of, 6 ofand 7 of.accounts for 74.7% of the identified strains, it is the dominant pathogen of wheat crown rot in Shandong Province.The results of pathogenicity showed that different strains ofspp. had pathogenicity to wheat plants, buthad the strongest pathogenicity.

Wheat crown rot; pathogenic bacteria;; pathogenicity

S435.121

A

1000-2324(2019)05-0753-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.05.004

2019-03-01

2019-04-26

國家重點研發計劃課題(2017YFD0201705);山東省現代農業產業技術體系創新團隊建設專項資金(SDAIT-01-09)

孟程程(1993-),男,在讀碩士,專業方向:植物病理學. E-mail:198227006@qq.com

*同等貢獻:孫曉鳳(1994-),女,在讀碩士,專業方向:植物病理學. E-mail:2536606095@qq.com

Author for correspondence. E-mail:jfyu@sdau.edu.cn