長鏈非編碼RNA BDNF-AS在乳腺癌中的表達及作用

吳多明 武力 張曉斌

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，病死率位居第4 位，并呈現逐年上升的趨勢。目前，治療乳腺癌的手段主要包括手術、化療和放療，但很多機制仍未闡明。近年來，基因治療發展成為診療腫瘤的研究熱點，探尋與乳腺癌相關的抑癌基因和促癌基因為乳腺癌的診治提供了新的研究方向［1］。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類轉錄本長度超過200 nt的非編碼RNA。研究報道，多種lncRNA在乳腺癌的發生、發展中起著重要的作用［2］。lncRNA 腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）-AS是BDNF的天然反義轉錄物。生物信息學分析發現，乳腺癌組織中47個lncRNA表達具有顯著性差異，其中lncRNA BDNF-AS表達顯著下調［3］。BDNF與乳腺癌發病、預后和耐藥等密切相關［4］，因此，探討lncRNA BDNF-AS在乳腺癌發生、發展中具有重要意義。本研究旨在通過檢測乳腺癌患者的癌組織與癌旁正常組織中的BDNF-AS表達差異，探討BDNFAS對乳腺癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本收集 隨機選取2016年1月至2018年12月88例于蘭州大學第一醫院行乳腺癌手術切除患者的組織標本，均經病理學確診，術前未行放、化療等任何治療，標本中的癌旁組織距癌組織5 cm 左右。本研究由蘭州大學第一醫院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.1.2 細胞和試劑 正常人乳腺細胞系HBL-100和人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468和SK-BR-3購于美國模式培養物保藏所細胞庫。培養基和胎牛血清購于美國BI公司。Trizol、RNA提取試劑盒和反轉錄試劑購于山東寶生物工程有限公司。lncRNA BDNF-AS、BDNF 和β-actin 引物、pcD?NA3.1、pcDNA3.1-BDNF-AS 和LipofectamineTM2000由廣州銳博生物科技有限公司設計合成和提供。MTT、Caspase-3 活性檢測試劑盒購于江蘇碧云天生物技術公司。一抗（Bax、Bcl-2、MMP-9、E-cadherin和BDNF）和羊抗鼠二抗購于美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 乳腺癌細胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-468和SK-BR-3）及正常乳腺細胞HBL-100使用10%胎牛血清和高糖DMEM培養基培養，MCF-7細胞使用10%胎牛血清和RPMI 1640培養基培養，均在37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。

1.2.2 細胞轉染 細胞接種于培養板中，待細胞匯合至60%～70%，使用脂質體LipofectamineTM2000 包載pcDNA3.1-BDNF-AS 轉染至MDA-MB-231 細胞內。通過RT-qPCR檢測BDNF-AS表達，評價其轉染效率。

1.2.3 MTT 法檢測 細胞在培養箱中培養至所需時間（0、12、24和48 h）后，加入MTT 溶液反應4 h，吸棄培養基，加入DMSO 溶解，490 nm波長下檢測OD 值，反映細胞活性。

1.2.4 比色法檢測Caspase-3 活性 提取細胞裂解液中總蛋白，并測定濃度。參照試劑盒說明書配制反應體系，37℃孵育2 h，405 nm波長下檢測OD值。

1.2.5 EdU 檢測細胞增殖能力 細胞培養板中加入EdU 滲入工作液，繼續培養3 h 后，經4%多聚甲醛固定，加入0.5%TritonX-100 打孔，再加入染色液孵育30 min，DAPI染核。于熒光顯微鏡下拍照，藍色為細胞核，綠色為EdU 陽性細胞即新增殖的細胞，計算EdU 陽性率，反映細胞增殖能力。EdU 陽性率=EdU陽性細胞數/DAPI染色的總細胞數。

1.2.6 RT-qPCR 檢測lncRNA BDNF-AS表達組織或細胞經Trizol法提取總RNA，反轉錄獲得cDNA，使用ABI-7300PCR 儀進行擴增和檢測，并分析計算其表達量。引物序列如下：BDNF-AS 上游為5'-AGCC ATGTGACTGATCTTCG-3'，下游為5'-GGAGCCAAC AAACAACTGGT-3'；BDNF 上游為5'-AAACATCCG AGGACAAGGTG-3'，下游為5'-AGAAGAGGAGGCT CAAAGG-3'；β-actin 上游為5'-CATGTACGTTGCTA TCCAGGC-3'，下游為5'-CTCCTTAATGTCACGCAC GAT-3'。

1.2.7 Western blot 檢測蛋白表達 刮取培養板中細胞，3 000 rpm/min，離心60 min后收集蛋白裂解液，吸取上清，加入上樣緩沖液，99℃變性，蛋白濃度由BCA蛋白測定試劑盒測定，并計算20 μg總蛋白對應的上樣體積。將蛋白濕轉至PVDF 膜上，在4℃下使用一抗（Bax、Bcl-2、MMP-9、E-cadherin 和BDNF）孵育過夜，TBST漂洗，加入二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗，顯影。

1.2.8 細胞劃痕實驗 將MDA-MB-231細胞接種在6孔板中，待細胞融合度達100%時，使用移液器頭垂直劃出3個間隔，置于含不同干預因素的無血清培養基中培養。于0、24和48 h分別拍照，比較劃痕寬度。

1.2.9 Transwell細胞侵襲實驗 將MDA-MB-231細胞接種于未涂Matrigel的Transwell小室，繼續培養24 h后，棉簽擦凈未遷移的細胞，結晶紫染色，顯微鏡下計數每一視野內穿過膜的細胞數目。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計數資料采用χ2檢驗，采用均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析one-way ANOVA 比較多組間差異，采用t檢驗比較兩組間差異。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA BDNF-AS 在乳腺癌患者癌組織和乳腺癌細胞系中的表達

88 例乳腺癌患者的癌旁組織較癌組織中ln?cRNA BDNF-AS 表達下調（圖1A），與正常的乳腺細胞相比lncRNA BDNF-AS 在乳腺癌細胞系中表達下調，其中在MDA-MB-231 細胞中下調最顯著（圖1B）。因此，后續lncRNA BDNF-AS 過表達的細胞功能檢測選擇在MDA-MB-231細胞完成。

圖1 乳腺癌組織和細胞系中lncRNA BDNF-AS的表達

2.2 乳腺癌患者組織中lncRNA BDNF-AS 表達與臨床病理特征關系

以乳腺癌患者lncRNA BDNF-AS 的平均表達水平為cut-off 值，分為低表達43 例和高表達45 例。BDNF-AS 的表達與TNM 分期（P＜0.05）和淋巴結轉移（P＜0.05）呈負相關，但與年齡、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體-2（HER-2）無關（P＞0.05，表1）。

2.3 過表達lncRNA BDNF-AS 對乳腺癌細胞增殖的影響

與空白質粒pcDNA3.1比較質粒pcDNA3.1-BDNFAS可過表達lncRNA BDNF-AS（圖2A），過表達lncRNA BDNF-AS可降低MDA-MB-231細胞活性（圖2B），且減少EdU 陽性細胞數（圖2C、D），表明過表達lncRNA BDNF-AS可抑制乳腺癌細胞增殖。

2.4 過表達lncRNA BDNF-AS 對乳腺癌細胞凋亡影響

過表達lncRNA BDNF-AS可顯著增加Caspase-3的活性（圖3A），并下調Bcl-2蛋白和上調Bax蛋白表達（圖3B、C），表明過表達lncRNA BDNF-AS 可促進乳腺癌細胞凋亡。

表1 88例乳腺癌患者組織中lncRNA BDNF-AS表達與臨床病理特征關系

2.5 過表達lncRNA BDNF-AS 對乳腺癌細胞遷移和侵襲的影響

細胞劃痕實驗表明過表達lncRNA BDNF-AS 可抑制乳腺癌細胞遷移（圖4A），Transwell 實驗結果表明過表達lncRNA BDNF-AS 可抑制細胞侵襲（圖4B），pcDNA3.1-BDNF-AS 可下調MMP-9 蛋白和上調E-cadherin 蛋白表達（圖4C），進一步證實過表達lncRNA BDNF-AS抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲。

2.6 過表達lncRNA BDNF-AS對BDNF表達的影響

過表達lncRNA BDNF-AS 可顯著抑制乳腺癌細胞中的BDNF mRNA 和蛋白的表達（圖5），表明ln?cRNA BDNF-AS負性調控BDNF表達。

圖2 質粒pcDNA3.1-BDNF-AS對lncRNA BDNF-AS表達和乳腺癌細胞增殖的影響

圖3 質粒pcDNA3.1-BDNF-AS對乳腺癌細胞凋亡的影響

圖4 質粒pcDNA3.1-BDNF-AS對乳腺癌細胞遷移和侵襲的影響

圖5 質粒pcDNA3.1-BDNF-AS對BDNF表達的影響

3 討論

近年來，lncRNAs 在乳腺癌中的作用逐步被揭示［5-6］，如乳腺癌組織中的lncRNA HOTAIR 表達上調與乳腺癌的分化程度和轉移密切相關，lncRNA HO?TAIR可誘導乳腺癌細胞侵襲［7］。本課題組前期研究發現，在乳腺癌組織和乳腺癌細胞中lncRNA GASL1表達水平下調，lncRNA GASL1抑制MCF-7細胞的增殖，促進其凋亡［8］。此外，本課題組還發現在乳腺癌組織中lncRNA AFAP1 AS1 表達上調與腫瘤惡性程度和預后密切相關［9］。

有研究報道，在結腸癌、宮頸癌和食道癌癌組織中lncRNA BDNF-AS 表達下調，參與癌細胞的增殖、遷移和侵襲［10-12］。本研究發現，相比乳腺癌患者癌旁組織，癌組織中lncRNA BDNF-AS 表達顯著下調，進一步分析lncRNA BDNF-AS 表達水平與乳腺癌患者臨床病理特征的相關性發現，癌組織中lncRNA BDNF-AS 表達與TNM分期和淋巴結轉移呈負相關，提示lncRNA BDNF-AS 可能參與乳腺癌的發生、發展。此外，在乳腺癌細胞株和正常乳腺細胞中，本研究檢測lncRNA BDNF-AS的表達發現，在乳腺癌細胞中lncRNA BDNF-AS 表達顯著低于正常乳腺細胞。為確證lncRNA BDNF-AS在乳腺癌中的作用，進一步探討lncRNA BDNF-AS 對乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，發現過表達lncRNA BDNF-AS可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進凋亡，表明lncRNA BDNF-AS對乳腺癌具有抑癌作用。

lncRNA BDNF-AS 屬于反義lncRNA。反義ln?cRNA 是一類從蛋白或非蛋白編碼基因的相反鏈上轉錄而來的lncRNA，常與編碼蛋白的基因完全或部分互補。研究表明，反義lncRNA 可能通過特殊的二級結構以及抑制翻譯過程等作用機制負向調控正義基因的表達［13-14］。lncRNA BDNF-AS 的正向基因為BDNF，在乳腺癌組織中BDNF高表達，并與乳腺癌淋巴結轉移、腫瘤復發、生存期短和預后不良相關［9］。因此，本研究進一步觀察乳腺癌細胞中lncRNA BDNF-AS 對BDNF 的調節作用，發現過表達lncRNA BDNF-AS 可抑制BDNF 表達。有研究發現，視網膜母細胞瘤中BDNF-AS通過下調BDNF抑制細胞周期轉換，誘導細胞周期阻滯于G0/G1期［15］?；谏鲜鲅芯?，本研究推測lncRNA BDNF-AS 可能通過依賴于BDNF的下游信號分子負性調控乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移。

綜上所述，本研究發現lncRNA BDNF-AS表達與乳腺癌惡性程度和轉移相關，其在乳腺癌組織和乳腺癌細胞中均表達下調。lncRNA BDNF-AS 促進乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，并抑制凋亡，其機制與上調BDNF 表達相關。lncRNA BDNF-AS 可能會成為乳腺癌診斷的新型生物標志物和防治乳腺癌的新靶點。