AJUBA在口腔鱗癌中的表達和意義及其相關機制

姚曉峰 金銳 陶英杰 郭文宇

口腔鱗癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部常見的第二大高發惡性腫瘤，約占口腔頜面部惡性腫瘤的90%。OSCC是對于口腔中惡性腫瘤的統稱，包括舌、牙齦、唇、頰、口底、軟硬腭等部位發生的癌癥，具有侵襲性強、易早期淋巴結轉移的特點。AJUBA（ajuba LIM protein）基因位于人類染色體14q11.2［1］，蛋白結構與LIM 家族的其他成員相似，通過LIM 或者preLIM 結構與其他多種蛋白或DNA 結合，作為支架蛋白參與多種生物學過程，發揮多種生物學作用［2］。在腫瘤的發生發展中，AJUBA參與多種信號通路的調節。在惡性間皮瘤中，AJUBA 通過調控Hippo信號轉導抑制細胞增殖［3］。此外，AJUBA通過加強β-catenin 和GSK-3β 之間的結合促進GSK-3β介導的β-catenin 磷酸化，從而對Wnt 信號通路進行負調節［4］。目前，AJUBA 在OSCC 中的研究鮮見報道，其在OSCC中的表達情況及對腫瘤細胞增殖和侵襲的影響仍有待探究。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2010年2月至2015年12月天津醫科大學腫瘤醫院OSCC組織標本共120例。其中男性75例，女性45 例；年齡≤60 歲54 例，＞60 歲66 例；T1+T2 期73例，T3+T4期47例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法 石蠟包埋切片后，常規脫蠟，3%H2O2處理30 min，檸檬酸鈉抗原修復，一抗4℃過夜孵育，加入二抗孵育30 min 后，DAB 顯色，蘇木素復染，脫水后中性樹膠封片，采集圖像并分析AJU?BA表達情況。根據陽性腫瘤細胞所占百分數進行陽性率評分，≤5%、5%～25%、25%～50%、≥50%分別計0～3 分；染色強度評分：無著色為0 分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3 分，兩項評分相乘所得分數為最終評分。120 例OSCC 組織標本按評分升序排列，低表達60例，高表達60例。

1.2.2 RNA 提取與qPCR 采用Trizol 法提取28 對OSCC 及癌旁組織總RNA，定量后吸取1 μg RNA，通過逆轉錄試劑盒將其逆轉錄成cDNA。通過SYBR Green mix 對cDNA 進行qPCR 實驗，以GAPDH 作為內參，檢測AJUBA及Snail的表達情況。

1.2.3 細胞培養 人OSCC細胞系Tca8113和TSCCA均購于中國科學院細胞庫，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養。

1.2.4 質粒及siRNA轉染 OSCC細胞接種于6孔板中，融合度達70%～80%時，利用Lipofectamine 3000將2.5 μg質粒DNA轉染至Tca8113和TSCCA細胞中。AJUBA特異性siRNA及陰性對照購于吉瑪基因（蘇州）。當6孔板中細胞融合度達40%時，采用RNAiMax轉染30 pmol si-AJUBA至Tca8113和TSCCA細胞中，48 h后進行表達檢測或功能實驗研究。

1.2.5 MTT實驗 將OSCC細胞消化計數后，接種于96 孔板中（1×103個細胞/孔）。分別于第1、2、3、4、5天采用MTT法檢測細胞增殖情況。具體步驟：100 μL培養基加入10 μL MTT 溶液，37℃孵育4 h 后吸去上清，加入150 μL DMSO 室溫孵育10 min，490 nm 波長檢測OD并分析。

1.2.6 Western blot 將OSCC 細胞用PBS 清洗2 遍，加入細胞裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，收集上清采用BCA 法進行蛋白定量。蛋白變性后，SDS-PAGE電泳。轉膜完成后，5%脫脂牛奶封閉1 h，相應一抗4℃過夜孵育。TBST 洗滌3 次后，加入相應二抗室溫孵育1 h，ECL化學發光法曝光檢測蛋白的表達情況。

1.2.7 克隆形成實驗 Tca8113和TSCCA細胞接種于6孔板中（5×102個細胞/孔），培養14 d后，冰甲醇固定15 min，0.1%結晶紫染色，PBS清洗后，采集圖像并計數。

1.2.8 劃痕實驗 OSCC細胞消化后鋪于6孔板中，當細胞融合度約100%時，使用10 μL 移液槍槍頭對孔中細胞劃痕，PBS清洗以去除脫落細胞。24 h后采集圖像，并采用Image J 圖像處理軟件對細胞遷移面積進行分析。

1.2.9 Tranwell 實驗 OSCC 細胞消化后用無血清培養基重懸，計數后加入已預鋪好Matrigel 的Transwell小室中，小室下方加入600 μL含20%胎牛血清的RP?MI 1640 培養基。培養24 h 后，用棉簽擦拭掉小室膜上方細胞，甲醇固定15 min，0.1%結晶紫染色，PBS清洗后采集圖像并分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析，數據以表示，實驗數據通過3次獨立實驗獲得。兩組樣本間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 AJUBA在OSCC組織中的表達及與預后的關系

通過qPCR 檢測及TCGA 數據庫分析發現，AJU?BA 在OSCC 組織中的表達水平顯著升高（圖1A，1B）。免疫組織化學法結果顯示OSCC組織中AJUBA表達顯著高于癌旁正常組織（圖1C）。同時發現AJU?BA表達與OSCC的T分期、淋巴結轉移及復發呈正相關，其表達越高，腫瘤分化越差（表1）。與AJUBA 低表達患者相比，AJUBA 高表達患者的預后相對較差（圖1D，P=0.019）。

表1 AJUBA表達與OSCC臨床病理指標的關系

2.2 AJUBA對OSCC細胞的增殖和侵襲

在Tca8113 和TSCCA 中敲降AJUBA 后，腫瘤細胞的增殖能力受到顯著削弱（圖2A）。通過克隆形成實驗發現敲降AJUBA 能夠抑制Tca8113和TSCCA 細胞的克隆形成（圖2B）。此外，與陰性對照組相比，si-AJUBA 組的劃痕面積較大，表明AJUBA 表達下調能夠導致OSCC 細胞的遷移能力降低（圖2C）。隨后進行Transwell 實驗進一步探究AJUBA 對OSCC 細胞侵襲的影響。結果顯示敲降AJUBA 后，Transwell 小室膜下方的腫瘤細胞數顯著減少，OSCC 細胞的侵襲能力受到顯著抑制（圖2D）。

2.3 AJUBA對OSCC細胞Snail表達的影響

Western blot檢測結果表明，過表達AJUBA后，OSCC細胞中Snail表達升高，同時N-cadherin和Vimentin表達增加，E-cadherin表達下降。而敲減AJUBA導致Snail、N-cadherin和Vimentin表達降低，E-cadherin表達上調（圖3）。以上結果表明AJUBA可能通過調控Snail影響OSCC的上皮間質轉化。

2.4 OSCC中AJUBA與Snail的相關關系

通過qPCR檢測發現，OSCC組織中的Snail mRNA水平顯著高于正常組織（圖4A，P=0.00 1）。Spearman相關性分析顯示AJUBA與Snail表達呈正相關（圖4B，P=0.001）。通過TCGA數據庫分析發現Snail表達升高，提示OSCC患者預后不良（圖4C）。

圖1 AJUBA在OSCC中高表達及預后

圖2 AJUBA對OSCC細胞的增殖和侵襲

圖3 AJUBA對OSCC細胞Snail及下游蛋白表達的影響

圖4 Snail在OSCC中的表達及與AJUBA表達的相關關系

3 討論

研究表明AJUBA 能夠促進多種腫瘤進展，AJU?BA可與SP1形成復合體，誘導下游基因表達，促進胰腺癌的增殖［5］。在食管鱗癌中，AJUBA能夠通過上調MMP10 和MMP13 的表達從而增強腫瘤細胞的運動侵襲能力［6］。然而也有證據顯示，AJUBA可以通過調控β-catenin 和YAP 通路，抑制肝癌細胞生長從而發揮抑癌基因的作用［7］。這可能與不同的細胞背景有關［8］。目前，AJUBA 在OSCC 中的研究較少，其發揮的功能及相關調控機制仍有待探究。本研究首先檢測AJUBA 在OSCC 中的表達情況，結果顯示AJUBA在OSCC中顯著高表達，并且提示不良預后。因此推斷AJUBA可能促進OSCC進展。

此外，免疫組織化學法結果顯示AJUBA 的表達與T 分期及淋巴結轉移呈正相關，因此AJUBA 可能在OSCC 的增殖和侵襲過程中發揮重要作用。通過功能實驗發現敲降AJUBA 能夠顯著抑制OSCC 細胞的增殖和侵襲能力。這充分證實了AJUBA 在OSCC中發揮著促癌基因的作用，而AJUBA 調控的具體機制則需進一步探究。

上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transi?tion，EMT）是上皮細胞獲得間質表型或成纖維樣特性時出現的暫時、可逆的生物學過程［9］，解釋了腫瘤轉移的起始步驟，在腫瘤研究中受到越來越多的關注［10］。EMT發生后，上皮細胞失去極性、細胞間連接降解、細胞骨架結構重組、細胞形態改變，而這些改變使細胞獲得了更高的遷移、侵襲和降解細胞外基質的能力［11］。因此，本研究進一步檢測AJUBA對OS?CC 細胞EMT 的影響，發現敲減AJUBA 后，上皮樣標志物E-cadherin 表達上調，而間質樣標志物Vimentin及N-cadherin 表達下降，這表明AJUBA 能夠通過調控EMT發生而促進OSCC的侵襲轉移。

大量研究表明Snail是調控EMT過程的重要轉錄因子，在多種腫瘤中（如胰腺癌、結直腸癌、乳腺癌、OSCC 及惡性黑色素瘤等）均可轉錄抑制E-cadherin的表達來促進EMT 的發生［12-14］。本研究發現敲降AJUBA 能夠抑制Snail 的表達，同時在OSCC 中，兩者的表達呈正相關。因此本研究提示，AJUBA 通過影響Snail 表達從而下調E-cadherin 并促進EMT 的發生。但AJUBA 與Snail 之間的具體調控機制仍值得深入發掘。

綜上所述，本研究發現AJUBA 在OSCC 中高表達，且提示不良預后。AJUBA能夠調控Snail表達，從而影響OSCC的細胞增殖、侵襲及EMT發生。本研究初步揭示了AJUBA在OSCC中的功能及調控機制，為OSCC的臨床診療提供了理論依據和新的思路。