miRNA-613在乳腺癌中的表達及作用機制

朱克鵬 肖勛蓉 羅義 弋文 尹均明 楊川 杜果城

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，同時也是女性癌癥相關性死亡最主要的原因。微小RNA（microRNA，miRNA）-613 是近年來發現的miR?NA 家族重要成員之一，研究發現其在宮頸癌［1］、胃癌［2］、卵巢癌［3］及非小細胞肺癌［4］等多種惡性腫瘤中異常表達，可能與惡性腫瘤的發生進展相關，但在乳腺癌中miRNA-613 表達及作用機制尚不完全清楚。本研究旨在通過檢測乳腺癌組織和細胞中miRNA-613的表達，進一步探討miRNA-613對乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響及可能的分子機制，為乳腺癌的靶向治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集2017年5月至2018年5月91例于南充市中心醫院手術切除的乳腺癌患者的組織標本，癌旁組織距腫瘤邊緣5 cm 以上，組織離體后30 min 內存儲于液氮中，轉移至-80℃低溫冰箱待檢測?；颊呶葱蟹呕熂捌渌鼓[瘤治療，術后病理均經病理學檢測確診。本研究獲得醫院倫理委員會批準且得到受試者知情同意。

1.1.2 細胞與主要試劑 人高侵襲轉移性乳腺癌細胞系MDA-MB-231 和MDA-MB-468、低侵襲轉移性乳腺癌細胞系MCF-7 及人正常乳腺上皮細胞系HBL-100 均 購 自 美 國ATCC 公 司。TRIzol 及Lipo?fectamine 3000均購自美國Invitrogen公司，miRNA-613及U6 引物、miRNA-613 模擬物、模擬物陰性對照均購自上海吉瑪制藥公司；逆轉錄及實時熒光定量PCR（quantitative real time-PCR，qRT-PCR）試劑盒購自大連寶生物公司；CCK-8 試劑盒購自江蘇碧云天生物公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；Matrigel基質膠購自美國BD 公司；野生型、突變型雙熒光素酶報告質粒pMIR-SOX9-WT、pMIR-SOX9-Mut 均購自廣州銳博生物公司；雙熒光素酶報告基因活性檢測試劑盒購自美國Promega 公司；SOX9、β-catenin、GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司；E-Cadherin和Vimentin抗體購自美國CST公司；HRP標記的二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測 qRT-PCR擴增條件為95℃預變性10 min，95℃變性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸10 s，共40個循環。miRNA-613引物序列上游為5'-GTGAGT GCGTTTCCAAGTGT-3'，下游為5'-TGAGTGGCAAAG AAGGAACAT-3'；U6 引物序列上游為5'-GCGCGT CGTGAAGCGTTC-3'，下游為5'-GTGCAGGGTCCGAGG T-3'。以U6作為內參，miRNA-613表達水平采用2-△△Ct法計算，△△Ct=［Ct（miRNA-613）-Ct（U6）］實驗組-［Ct（miRNA-613）-Ct（U6）］對照組。

1.2.2 TCGA數據庫分析 分析TCGA數據庫中乳腺癌患者的miRNA-613 表達和相對應的生存資料，對miRNA-613 低表達組538 例和高表達組537 例進行生存分析。

1.2.3 細胞轉染 取對數生長期的MDA-MB-231細胞接種于6孔板進行轉染，轉染后細胞分為miRNA-613模擬物組和陰性對照（NC）-模擬物組，轉染24 h后收集細胞，檢測轉染效率行后續實驗。

1.2.4 CCK-8實驗 收集對數生長期細胞接種于96孔板中，轉染后每24 h加入10 μL/孔CCK-8溶液，繼續避光孵育2 h，酶標儀測定各孔450 nm波長處的吸光度值（A450nm）。

1.2.5 Transwell 侵襲及遷移實驗 Transwell 小室置于24孔板內，小室內膜均勻涂抹Matrigel膠凝固成膜行侵襲實驗，使用無血清培養基重懸細胞制作細胞懸液，加入上室，同時在下室加入500 μL含有10%胎牛血清的培養基，37℃孵箱繼續培養24 h 后取出小室，棉簽輕輕擦拭掉上室內膜黏附的細胞，甲醛固定、染色，顯微鏡下計數穿膜細胞數。Transwell 小室內膜上不涂抹Matrigel膠，同樣操作行遷移實驗。

1.2.6 miRNA-613 靶基因SOX9 的預測 通過miR?NA在線靶基因預測網站TargetScan和miRanda，預測miRNA-613作用靶基因SOX9。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗 取MDA-MB-231接種于96孔板，將雙熒光素酶報告質粒和miRNA-613模擬物（或NC-模擬物）共轉染至MDA-MB-231 細胞，分為miRNA-613模擬物+pMIR-SOX9-WT組、NC-模擬 物+pMIR-SOX9-WT 組、miRNA-613 模擬物+pMIR-SOX9-Mut 組、NC-模擬物+pMIR-SOX9-Mut組。轉染48 h后裂解細胞，檢測熒光素酶活性。

1.2.8 Western blot 檢測 收集細胞樣品，提取細胞總蛋白，每組取等量蛋白樣品行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶里室溫封閉2 h后，加入一抗SOX9、β-catenin、E-Cadherin、Vimentin 和GAPDH 抗體，次日室溫孵育后再加入二抗。超敏ECL發光試劑進行顯影。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料采用表示，數據比較采用t檢驗或單因素方差分析；計數資料采用n表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織和細胞中miRNA-613的表達

乳腺癌組織中miRNA-613的表達顯著低于癌旁組織（P＜0.05，圖1A），乳腺癌細胞系MCF-7、MDAMB-231、MDA-MB-468中miRNA-613的表達顯著低于正常乳腺上皮細胞系（P＜0.05），并且高侵襲轉移性乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468 中miR?NA-613 的表達顯著低于低侵襲轉移性乳腺癌細胞系MCF-7（P＜0.05，圖1B）。

圖1 乳腺癌組織和細胞中miRNA-613的表達

2.2 乳腺癌組織中miRNA-613 表達與患者臨床病理特征的相關性

以乳腺癌組織中miRNA-613表達水平的均值作為界值，分為低表達miRNA-613 組47 例和高表達miRNA-613 組44 例，分析顯示miRNA-613 表達與TNM 分期和淋巴結轉移有顯著性相關（P＜0.05），而與年齡、腫瘤最大直徑、組織學分級、ER、PR、HER-2狀態無顯著相關（P＞0.05，表1）。TCGA 數據庫分析顯示，miRNA-613 表達與乳腺癌患者的總生存率無關（P＞0.05，圖2）。

2.3 上調miRNA-613 表達對MDA-MB-231 細胞增殖活性的影響

miRNA-613模擬物組的miRNA-613表達明顯高于NC-模擬物組（P＜0.05，圖3A），miRNA-613模擬物組的A450nm值明顯低于NC-模擬物組（P＜0.05，圖3B）。

表1 miRNA-613表達與乳腺癌患者臨床病理特征的相關性

圖2 miRNA-613表達對乳腺癌患者總生存率的影響

2.4 上調miRNA-613 表達對MDA-MB-231 細胞侵襲和遷移能力的影響

miRNA-613模擬物組細胞侵襲和遷移細胞數目均明顯少于NC-模擬物組（P＜0.05，圖4）。

2.5 miRNA-613對靶基因SOX9的驗證

miRNA 在線靶基因預測網站TargetScan 和miRanda顯示miRNA-613存在能靶向結合SOX9的3'UTR，雙熒光素酶報告實驗檢測結果顯示共轉染miRNA-613模擬物進入MDA-MB-231 細胞后，可顯著降低野生型pMIR-SOX9-WT 的熒光素酶活性（P＜0.05），而不能抑制突變型pMIR-SOX9-Mut的熒光素酶活性（P＞0.05，圖5）。

2.6 上調miRNA-613 表達對SOX9、β-catenin、Vi?mentin和E-Cadherin蛋白表達的影響

miRNA-613 模擬物組細胞中的SOX9、β-catenin和Vimentin蛋白表達水平明顯低于NC-模擬物組（均P＜0.05，圖6），而E-Cadherin 蛋白表達水平明顯高于NC-模擬物組（P＜0.05，圖6B）。

圖3 CCK-8實驗檢測miRNA-613模擬物組上調miRNA-613表達對MDA-MB-231細胞增殖活性的影響

圖4 Transwell實驗檢測miRNA-613模擬物組上調miRNA-613表達對MDA-MB-231細胞侵襲和遷移能力的影響

圖5 miRNA-613靶基因的驗證

圖6 Western blot 檢測miRNA-613模擬物組細胞中的相關蛋白表達水平

3 討論

研究證實，miRNA-613 在惡性腫瘤的發生發展中起著重要的調控作用［2-4］，但乳腺癌中miRNA-613的研究較少，并且作用機制尚不清楚。本研究發現，miRNA-613在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系中表達顯著降低，與已有研究結果一致［5-6］。本研究還發現，miRNA-613 在高侵襲轉移性乳腺癌細胞系中的表達顯著低于低侵襲轉移性乳腺癌細胞系，并且miRNA-613表達與患者TNM分期和淋巴結轉移有顯著性相關，乳腺癌TNM 分期中的Ⅲ期患者組織中的miRNA-613表達明顯低于Ⅰ+Ⅱ期患者，有淋巴結轉移患者組織中的miRNA-613表達明顯低于無淋巴結轉移者，進一步提示miRNA-613 異常低表達可能與乳腺癌的侵襲轉移及進展有關。

上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transi?tion，EMT）是惡性腫瘤侵襲轉移的關鍵步驟。本研究發現，上調乳腺癌細胞中miRNA-613 表達能明顯抑制腫瘤細胞的增殖活性、侵襲及遷移能力，同時Vi?mentin蛋白表達明顯下降，E-Cadherin蛋白表達明顯升高，提示miRNA-613 能通過調控EMT 影響乳腺癌細胞的侵襲及轉移。本研究進一步通過生物信息學網站預測SOX9 可能是miRNA-613 下游靶向調控基因，并且在肝細胞癌［7］和膠質瘤［8］中也發現miRNA-613 通過靶向調控SOX9 抑制腫瘤細胞的增殖及轉移。Xue等［9］研究發現，miRNA-613通過靶向調控SOX9 誘導胃癌細胞對順鉑的敏感性。本研究通過雙熒光素酶報告實驗證實，miRNA-613 能與SOX9 的3'UTR 特異性結合，Western blot 證實miR?NA-613 能負性調控SOX9 蛋白表達，證明SOX9 為miRNA-613 的直接調控靶基因。SOX9 是SOX 家族的重要成員之一，研究顯示SOX9 在腫瘤中異常表達，與惡性腫瘤的發生、進展以及不良預后有關［10］。抑制乳腺癌細胞中的SOX9表達，能抑制癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力及EMT 過程［11-12］。以上說明miRNA-613通過靶向調控SOX9表達影響EMT，從而抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移。

Wnt/β-catenin信號通路是影響腫瘤細胞EMT的重要分子通路。研究發現，SOX9能通過Wnt/β-catenin通路影響腫瘤細胞EMT，從而影響腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移能力［13-14］。本研究發現，上調乳腺癌細胞中miRNA-613表達，能顯著抑制miRNA-613靶基因SOX9蛋白的表達，進一步降低Wnt/β-catenin通路的關鍵分子β-catenin蛋白表達，癌細胞增殖及侵襲遷移能力下降，EMT受到抑制。以上說明miRNA-613可通過調控SOX9、Wnt/β-catenin信號通路抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲轉移及EMT。

綜上所述，在乳腺癌組織和細胞中miRNA-613異常低表達，并且與乳腺癌的侵襲轉移相關，miRNA-613可通過調控SOX9、Wnt/β-catenin信號通路抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲轉移及EMT，為乳腺癌的靶向治療提供新的研究方向。