老年膽囊癌患者手術前后血清VEGF-C及其受體fms樣酪氨酸激酶4水平變化及其臨床意義

王紹勇，鄧小凡

(1.成都市第十一人民醫院外一科，四川 成都 610081；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院外六科，四川 成都 610072)

膽囊癌位居膽道惡性腫瘤首位[1]，癥狀缺乏特異性，早期診斷困難，出現明顯癥狀時，已屬晚期，生存率低，尤其老年患者基礎狀況差，預后更差[2]。手術是膽囊癌主要治療途徑，但即便膽囊原發灶浸潤程度低，仍可能存在肝臟浸潤或淋巴結轉移，根治困難[3]。目前認為腫瘤侵襲轉移是其主要致死原因[4]，而淋巴管在惡性腫瘤生長轉移中有重要作用，可為腫瘤生長提供必需營養物質，增加生物異質性，促成其浸潤、轉移[5]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)系調節大部分腫瘤新生血管生成的關鍵因子，近期被證實在肺癌、肝癌淋巴轉移中有重要作用[6，7]。其中VEGF-C為誘導淋巴管內皮增殖及趨化的特異性因子，屬淋巴管有絲分裂素，其受體fms樣酪氨酸激酶4(fins like tyrosine kinase 4，Flt-4)特異性表達于淋巴管內皮細胞，促進癌細胞淋巴管生成，促成腫瘤淋巴轉移[8]。但有關VEGF-C及其受體Flt-4在老年膽囊癌中的表達及作用尚未見報道。本研究采用酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)對老年膽囊癌患者手術前后VEGF-C、Flt-4水平進行檢測，與膽囊腺瘤樣息肉進行對照，并將膽囊癌VEGF-C、Flt-4水平與患者臨床病理參數的關系展開研究，旨在明確兩者在膽囊癌發生、進展及轉移中的作用，為膽囊癌臨床診治提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料2014年1月至2018年4月成都市第十一人民醫院收治的72例老年膽囊癌患者(病例組)。納入標準：①經手術病理證實為膽囊癌；②年齡≥60歲；③初發初治，接受腹腔鏡膽囊癌根治術，術前均未接受放化療或其他抗腫瘤治療；④臨床資料完善。選取同期收治的42例老年膽囊腺瘤樣息肉患者作為對照組。納入標準：①病理證實為膽囊腺瘤樣息肉，接受腹腔鏡息肉切除術；②留存血樣標本；③臨床資料完善。排除標準：①均排除慢性肝炎、肝硬化；②心腎肺器質性功能障礙；③合并嚴重腦血管??；④合并其他惡性腫瘤；⑤繼發膽囊癌；⑥合并嚴重精神疾??；⑦預計生存期<3月；⑧臨床資料不全。病例組男31例，女41例；年齡60～79歲[(70.5±5.7)歲]；美國腫瘤聯合會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第7版TNM分期[9]：Ⅰ期12例，Ⅱ期27例，Ⅲ期28例，Ⅳ期4例；分化程度：低分化10例，中分化23例，高分化38例；病理類型：腺癌66例，鱗癌6例；腫瘤位置：升結腸14例，橫結腸18例，降結腸13例，乙狀結腸27例。對照組男18例，女24例；年齡61～78歲[(70.6±5.4)歲]。

1.2 方法兩組均采集術前1 d、術后1 周空腹外周血標本5 ml，靜置2 h后離心20 min，1000 r/s，取上清液低溫(-80 ℃)保存，采用ELISA法測定VEGF-C、Flt4水平，VEGF-C、Flt4 ELISA法試劑盒購自美國R&D公司，儀器為美國Bio-Rad公司Mlcroplate reader 800型酶標儀。待測樣本室溫融化，按說明書稀釋標準品、血清，加入樣本孔，封板，搖床孵育2 h，洗板4次，加入耦合物，封閉，搖床孵育2 h，洗板，混合顯色劑，加入孔板，避光孵育2 h，終止液終止反應，450 nm酶標儀讀取光密度值(optical density，OD)，繪制標準曲線，軟件計算樣本濃度。

1.3 觀察指標收集老年膽囊癌患者臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤直徑、臨床分期、病理分級、淋巴結轉移、肝臟侵犯等，分析術前1 d VEGF-C、Flt4水平與臨床病理參數的關系。

1.4 統計學方法采用SPSS 20.0軟件分析數據。計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；受試者工作特征曲線(ROC)評價血清VEGF-C、Flt4預測膽囊癌淋巴結轉移的價值；相關分析采用Pearson相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組VEGF-C、Flt4水平比較病例組術前1 d VEGF-C、Flt4均高于對照組(P<0.05)，術后1周，兩組VEGF-C、Flt4均降低，對照組低于病例組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組手術前后VEGF-C、Flt4水平比較 (pg/ml)

2.2 不同人口學資料膽囊癌患者血清VEGF-C、Flt4水平比較不同性別、不同年齡膽囊癌患者VEGF-C、Flt4水平比較差異無統計學意義(P> 0.05)，見表2。

2.3 不同病理資料膽囊癌患者血清VEGF-C、Flt4水平比較不同腫瘤直徑、病理類型膽囊癌患者VEGF-C、Flt4水平比較差異無統計學意義(P> 0.05)，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為中低分化、伴肝臟侵犯、伴淋巴結轉移的老年膽囊癌患者VEGF-C、Flt4高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、分化程度為高分化、不伴肝臟侵犯及淋巴結轉移的膽囊癌患者(P<0.05)，見表3。

表2 不同人口學資料老年膽囊癌患者血清VEGF-C、Flt4水平比較 (pg/ml)

表3 不同病理資料膽囊癌患者血清VEGF-C、Flt4水平比較 (pg/ml)

2.4 血清VEGF-C、Flt4預測膽囊癌淋巴結轉移的價值分析ROC曲線分析顯示：VEGF-C預測膽囊癌淋巴結轉移曲線下面積為0.827(95%CI：0.734～0.919)，當臨界值為388.83 pg/ml時VEGF-C預測膽囊癌轉移敏感度及特異性最高，分別為85.70%、73.30%；Flt4預測膽囊癌淋巴結轉移曲線下面積為0.744(95%CI：0.631～0.858)，當臨界值為513.541 pg/ml時Flt4預測膽囊癌淋巴結轉移敏感度及特異性最高，分別為82.10%、57.80%，圖1。

2.5 老年膽囊癌患者血清VEGF-C與Flt4表達相關性分析老年膽囊癌患者血清VEGF-C與Flt4表達呈正相關(r=0.491，P<0.001)，圖2。

圖1 血清VEGF-C、Flt4預測膽囊癌淋巴結轉移ROC曲線

圖2 老年膽囊癌患者血清VEGF-C與Flt4表達相關性分析

3 討論

膽囊癌約占膽道腫瘤的80%～95%，起病隱匿，惡性程度高，預后差，進展期或中晚期膽囊癌5年生存率低于5%，中位生存期低于6個月[10]。實體瘤生長、進展及轉移均與新生血管生成密切相關，癌細胞通過淋巴管及血管擴散至其他器官系惡性腫瘤典型生物學特點，同時也是影響患者預后的關鍵，故必須重視淋巴管生成在癌癥進展中的作用。VEGF-C屬VEGF家族分泌性二聚體糖蛋白，主要分布于血管內皮細胞、腫瘤細胞及纖維母細胞內，屬內皮細胞特異性絲裂原及血管通透因子，具有刺激淋巴管及血管生成雙向作用，可與其受體Flt4特異性結合，調節淋巴管內皮細胞生長因子生成，誘導腫瘤生長、進展及轉移[11]。目前已證實肺癌患者癌組織VEGF-C呈明顯高表達。但對老年膽囊癌患者血清VEGF-C的作用尚少見報道。本研究發現，老年膽囊癌患者血清VEGF-C表達水平明顯高于良性膽囊腺瘤樣息肉患者，推測VEGF-C可能存在促進腫瘤細胞生長作用，且與膽囊癌惡性生物學行為密切相關。分析機制為：VEGF-C作用為旁分泌形式，可與受體Flt4特異性結合，引起Flt4磷酸化，活化細胞骨架蛋白，促成淋巴管內皮細胞遷移；同時激活RAS/MAPK或JNK信號通路，誘導淋巴管內皮細胞激動蛋白重組，刺激癌細胞增殖及DNA有絲分裂，促成癌組織淋巴管生成及遷移。在進行手術治療后患者VEGF-C均明顯降低，這與手術治療后膽囊癌患者腫瘤負荷降低，癌細胞淋巴管及新生血管血流阻滯后VEGF-C表達降低有關。

Flt4屬絡氨酸激酶，在胚胎發育初期存在于所有內皮細胞內，后期主要分布于小靜脈及淋巴管，為成熟淋巴管內皮細胞特異性標志。研究發現，癌組織周邊新生淋巴管、腫瘤轉移組織淋巴結內淋巴內皮細胞均可見Flt4高表達。在同一組織內，VEGF-C與Flt4親和力較強，兩者形成淋巴管生成信號轉導通路，協同調控癌細胞間質血管網及淋巴管生成。本研究發現，老年膽囊癌患者血清Flt4表達水平較良性膽囊腺瘤樣息肉患者高，與VEGF-C表達趨勢一致，兩者表達呈正相關，在手術治療后降低，推測VEGF-C上調Flt4表達，兩者存在正性調控協同作用，考慮膽囊癌患者癌細胞自分泌輔以旁分泌途徑產生VEGF-C后作用于細胞膜Flt4受體，導致Flt4表達上調，刺激癌細胞浸潤、遷移；而在根治性切除術后腫瘤血管活性降低，VEGF-C表達減少，所刺激生成的Flt4表達降低。王若帆等[12]認為，VEGF-C及Flt4表達與腫瘤直徑無關。本研究發現，不同直徑膽囊癌患者VEGF-C、Flt4表達差異無統計學意義，與上述結論相同，故認為腫瘤直徑與膽囊癌淋巴結轉移無明顯關聯。對VEGF-C、Flt4表達與腫瘤分化程度的關系目前尚存在一定的爭論。陳晨等[13]認為，分化程度較低的癌組織VEGF-C表達水平較高。也有觀點認為，腫瘤分化程度與VEGF-C表達無明顯關聯。本研究發現，年齡、性別與膽囊癌患者血清VEGF-C及Flt4表達無關，而中低分化程度的膽囊癌患者血清VEGF-C及Flt4表達水平高于高分化患者，且VEGF-C、Flt4表達與膽囊癌臨床分期有關，提示兩者均與膽囊癌惡性進展有關，一般分化程度較低的膽囊癌患者細胞惡性生物學行為更典型，細胞增殖、轉移速度快，新生血管生成更多，故VEGF-C、Flt4表達水平較高。

本研究還發現，VEGF-C、Flt4表達與膽囊癌肝臟侵犯及淋巴結轉移有關，分析機制可能為：VEGF-C通過與受體Flt4作用可誘導膽囊癌淋巴管生成；血清VEGF-C受體Flt4表達上調可進一步提升淋巴管內皮細胞對VEGF-C的反應性，誘導淋巴管增生；而增生淋巴管增多為癌細胞淋巴管轉移及侵犯奠定了基礎，促進膽囊癌淋巴結轉移及肝臟侵犯。此外，本研究進行ROC曲線分析發現VEGF-C、Flt4預測老年膽囊癌淋巴結轉移價值均較高，當VEGF-C臨界值為388.83 pg/ml時VEGF-C預測膽囊癌轉移敏感度及特異性別為85.70%、73.30%；Flt4臨界值為513.541 pg/ml預測膽囊癌淋巴結轉移敏感度及特異性分別為82.10%、57.80%，兩組預測淋巴結轉移曲線下面積分別為0.827、0.744，VEGF-C整體價值略優于Flt4，為本研究的創新點，提示兩者均有望作為推測老年膽囊癌是否存在淋巴結轉移的依據。