肺炎支原體RNA恒溫擴增技術和血清抗體法在兒童肺炎支原體檢測中的比較

王紫荊，趙 云，胡小林，方 劍，尹清金，侯曉華，謝屹峰，謝光莉，馬云馳，莊 琴，謝巧林，周曉玲

(成都兒童?？漆t院內科一病區，四川 成都 610015)

支原體(MP)肺炎是由肺炎支原體引起的常見兒童呼吸道感染性疾病，主要臨床表現有：持續高熱、畏寒、厭食、劇烈咳嗽、頭痛、咽痛、胸骨下疼痛等癥狀，占肺炎住院患兒的10%～40%[1]，部分患兒可引起神經系統、血液系統、心血管系統和皮膚、肌肉、關節等并發癥，嚴重影響患兒的身體健康，故需盡早明確診斷、及時治療，但由于支原體肺炎的臨床征象和影像學不具有特征性[2]，給臨床早期診斷帶來困難。本研究采用肺炎支原體RNA恒溫擴增技術和血清抗體法同時對不同年齡、不同病程肺炎患兒進行支原體病原學檢測，評價兩種方法的檢測率，探討肺炎支原體RNA恒溫擴增技術在兒童肺炎早期診斷中的應用價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2017年3月至2018年12月在成都兒童?？漆t院住院的患兒2647例，男1501例，女1146例，入組標準：參照《兒科學》第八版兒童肺炎診斷標準：有發熱(部分可無發熱)、咳嗽、呼吸急促、肺部中細濕羅音、胸部影像學有肺炎改變。排除年齡≤28天的新生兒，本次入院前曾服用過大環內酯類抗菌藥物者。所有患兒于入院當日同時作咽拭子支原體RNA恒溫擴增技術檢測、血清支原體抗體檢測，還需作痰細菌培養、肝腎功能、心肌酶譜、電解質和X射線片、血常規、尿常規、大便常規等檢查，予以抗感染、霧化吸入、止咳化痰、退熱等處理。

1.2 方法儀器與試劑：實時熒光定量PCR儀由西安天隆科技有限公司生產，型號：TL988；試劑采用上海仁度生物技術有限公司生產的肺炎支原體核酸檢測試劑盒；支原體血清抗體檢測采用日本富士瑞必歐株式會社生產的肺炎支原體抗體檢測試劑盒。

1.2.1咽拭子肺炎支原體RNA恒溫擴增技術檢測

分為核酸提取和恒溫擴增檢測2個步驟。在核酸提取過程中，支原體裂解釋放出的核酸借助核酸提取液中的捕獲探針與磁性顆粒特異結合，通過清洗磁性顆粒而獲得純凈的MP靶標核酸(RNA)；在恒溫擴增檢測過程中，使用M-MLV反轉錄酶、T7.RNA多聚酶和優化探針技術來實現，反轉錄酶用于產生靶標核酸(RNA)的一個DNA拷貝，T7.RNA多聚酶從DNA拷貝上產生多個RNA拷貝，帶有熒光標記的優化探針和這些RNA拷貝特異結合，從而產生熒光，該熒光信號可由檢測儀器捕獲。檢測結果根據實時熒光信號的出現時間和強度，結合陽性對照、陰性對照、內標信號和熔解曲線對檢驗結果進行判定。

1.2.2支原體血清抗體檢測 被動凝集法；采用富士瑞必歐株式會社生產的肺炎支原體抗體檢測試劑盒，嚴格按說明書操作進行。血清學診斷標準：單份血清抗體滴度≥1：160為陽性。

1.3 統計學方法應用SPSS 21.0統計軟件對數據進行統計分析，檢出率的比較采用配對四格表資料χ2檢驗，P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種檢測方法的檢出率比較2647例兒童肺炎患兒中支原體RNA恒溫擴增法檢出肺炎支原體284例，檢出率10.73%，支原體血清抗體法檢出肺炎支原體212例，檢出率為8.01%，兩種方法檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=14.56，P< 0.05)，見表1。

表1 RNA恒溫擴增法與血清抗體法支原體檢出率比較 (n=2647)

2.2 不同病程患兒兩種檢測方法的檢出率比較病程≤7天組有1809例患兒，其中支原體RNA恒溫擴增法檢出肺炎支原體199例，檢出率11 %，支原體血清抗體法檢出肺炎支原體137例，檢出率7.57 %，差異有統計學意義(χ2=15.38，P< 0.05)。病程>7天組有838例，其中支原體RNA恒溫擴增法檢出肺炎支原體85例，檢出率10.14%，支原體血清學抗體法檢出肺炎支原體75例，檢出率8.95%，差異無統計學意義(χ2=0.94，P> 0.05)，見表2。

表2 病程≤7天和病程>7天患兒RNA恒溫擴增法與血清抗體法支原體檢出率比較

3 討論

支原體肺炎是兒童肺炎的常見類型，其臨床表現和影像學沒有特征性，在沒有病原檢查之前，容易與病毒性肺炎相混淆，故尋找一種早期、快速、準確檢測出肺炎支原體的方法，對臨床診斷、治療和防止抗菌素的濫用都有十分重要的意義。

肺炎支原體感染的確診，必須依賴于病原學檢查，目前支原體感染的病原學檢查主要有以下四種檢測方法：肺炎支原體分離和培養、支原體抗原檢測、支原體血清特異性抗體檢測、支原體核酸擴增技術。支原體分離和培養是診斷支原體感染的金標準，但常規支原體培養方法，條件要求苛刻，支原體生長緩慢，常規培養需要10～14天，甚至更長時間，盡管其檢出準確率高，但該方法費時、繁瑣，培養靈敏度低，不利于支原體感染的早期快速診斷；支原體快速培養方法是利用快速繁殖的肺炎支原體分解葡萄糖而產酸，產生大量氫離子，降低了培養基的PH值，使培養基中的酚紅指示劑從紅色轉變為黃色，來間接判斷培養基中有肺炎支原體生長，但其敏感性較低，特異性低，易受到真菌等因素影響而出現假陽性[3]；支原體抗原檢測具有簡單、快速的優點，適合于臨床早期診斷的要求，但患者咽拭子、痰液標本中肺炎支原體的含量低，不經過支原體擴增的抗原檢測靈敏度不高，因此在能利用核酸擴增技術診斷時，不推薦應用抗原檢測診斷；目前臨床上較為流行的檢測方法為支原體血清抗體法，但目前抗體診斷試劑敏感性不高，其檢查結果受患兒病程和年齡因素的影響。在支原體感染早期，支原體抗體尚未產生，早期檢測可出現假陰性；嬰幼兒由于免疫功能尚未發育完善，B細胞功能不足，產生抗體的能力較低，也可能出現假陰性[4]；支原體DNA核酸擴增技術可直接檢測患兒咽拭子或痰液標本中肺炎支原體的DNA，具有敏感度高和特異性高的優點，可用于支原體感染的早期診斷，但菌體死亡后其DNA可持續存在數月，故無法區分“死菌”和“活菌”，無法判斷療效，且易引發實驗室內交叉污染[1，5～7]，易出現假陽性；支原體RNA核酸擴增法是目前最新的分子診斷方法，模板和檢測都是用RNA做模板，RNA僅存在活菌中，菌體死亡后RNA快速降解，相比較傳統DNA核酸擴增技術，能有效區分“死菌”和“活菌”，在疾病初期、潛伏期、療效判斷、預后等各個階段能給臨床提供非常有價值的信息，另外，不存在交叉污染，具有檢測時間短，敏感度、特異度高，不會受到患兒年齡因素的影響[8]。

綜上，支原體RNA恒溫擴增技術可以作為一種新的方法用于肺炎支原體感染的早期臨床病原檢測，可以提高支原體感染的診斷水平，值得臨床大力推廣應用。