基于網絡藥理學研究黃連治療心房顫動的活性成分及作用機制

蔡 蕓，信琪琪，高 群，賈文浩，靳嘉麟，董 菲，叢偉紅，林 謙

心房顫動(atrial fibrillation，AF)是臨床最常見的心律失常之一[1]，其患病率和發病率都在持續升高，嚴重影響病人的生存質量。心房基質重構和電重構是心房顫動發生和維持的關鍵病理機制[2]。心房顫動屬中醫“心悸”范疇，痰熱擾心證已成為心房顫動病人的常見證候之一[3]。黃連源于《神農本草經》，其味苦，性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效[4]，針對心房顫動痰熱擾心的病機，現代醫家多加用黃連以發揮清心降火功效，往往可以取得較好的效果，但其作用機制尚不明確。

網絡藥理學是基于系統生物學的理論，運用專業網絡分析軟件，通過構建“藥物-靶點-疾病”的網絡，分析其協同關系的新學科。其強調中藥對疾病的多成分、多靶點、多途徑調節作用，從網絡層面闡釋中藥治療疾病的作用機制[5]，目前已廣泛應用到新藥開發、多靶點治療藥物等方面[6]。中藥多具有多成分、多靶點、多通路的特征，因此本研究擬通過網絡藥理學的方法，分析、預測黃連治療心房顫動的藥效基礎、作用靶點，為從分子水平、細胞水平和基因水平闡明黃連的作用機制提供參考依據。

1 方 法

1.1 黃連成分潛在靶點網絡構建 從TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Data-base and Analysis Platform)數據庫中檢索黃連所有成分及靶點，通過口服生物利用度(OB)、藥物相似性(DL)進行活性成分篩選，閾值設定為OB>30%、DL>0.18，Uniprot數據庫進行蛋白基因名的轉換，再通過Cytoscape3.2.1軟件對成分、潛在靶點進行可視化網絡構建，利用Bisogenet插件構建成分靶點蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interactions，PPI)網絡。

1.2 心房顫動疾病靶點網絡構建 以“atrial fibrillation”為關鍵詞分別檢索TTD、DrugBank、美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫，獲得疾病靶點，通過NCBI數據庫進行蛋白基因名的轉換，再通過Cytoscape3.2.1軟件進行疾病靶點可視化構建，利用Bisogenet插件構建疾病靶點PPI網絡。

1.3 藥物活性成分-疾病靶點核心網絡構建 通過Cytoscape3.2.1軟件的Merge功能，將以上構建得到的“成分靶點PPI網絡”與“疾病靶點PPI網絡”進行Merge分析，得到藥物-疾病共同相關的靶點，進一步通過Cytoscape的CytoNCA插件對“成分-靶點-疾病網絡”進行拓撲分析，計算出度值，進行核心網絡構建與分析。

1.4 基因富集通路可視化分析 利用David數據庫將藥物-疾病共同相關靶點進行Go注釋與KEGG富集通路分析，通過OmicShare平臺以高級氣泡圖進行可視化。

2 結 果

2.1 黃連成分-潛在靶點網絡 本研究通過OB、DL參數作為ADME篩選條件，刪除冗雜后最終得到11個活性成分、172個潛在靶點，構建得到的可視化網絡(見圖1)，包含180個節點和260條邊；通過Bisogenet插件構建黃連成分靶點PPI網絡(見圖2)，得到5 887個黃連潛在靶點，共145 163條邊。其中對治療心房顫動可能有作用的黃連活性成分主要包括小檗堿、小檗紅堿、表小檗堿、四氫小檗堿、小檗浸堿、黃麻苷A、木蘭花堿、巴馬汀、槲皮素、黃連堿、甲基黃連堿等(見表1)。

黃色代表黃連成分，紅色代表靶點

編號 CAS號 名稱OB(%)DLMOL001454633-66-9/2086-83-1berberine(小檗堿)36.860.78MOL00289415401-69-1/17388-19-1berberrubine(小檗紅堿)35.740.73MOL0028971816598epiberberine(表小檗堿)43.090.78MOL002903522-97-4(R)-Canadine(四氫小檗堿)55.370.77MOL002904549-21-3Berlambine(小檗浸堿)36.680.82MOL002907N/ACorchoroside A_qt(黃麻苷A)104.95 0.78MOL00062292618-98-9Magnograndiolide(木蘭花堿)63.710.19MOL0007853486-67-7/10605-02-4palmatine(巴馬汀)64.600.65MOL00009873123-10-1/74893-81-5/117-39-5quercetin(槲皮素)46.430.28MOL0014583486-66-6/6020-18-4coptisine(黃連堿)30.670.86MOL00266838763-29-0Worenine(甲基黃連堿)45.830.87

2.2 心房顫動疾病-靶點網絡 349個疾病靶點通過NCBI數據庫轉換為標準基因名，構建可視化網絡(見圖3)及“疾病靶點PPI網絡”(見圖4)，得到6 414個潛在疾病靶點，共153 752條邊。

圖3 疾病-靶點網絡

圖4 疾病-靶點PPI網絡

2.3 藥物活性成分-疾病靶點核心網絡 “成分靶點PPI網絡”與“疾病靶點PPI網絡”Merge分析后構建的“成分-靶點網絡”(見圖5)，包括4 517個藥物-疾病共同的靶點。進一步通過Cytoscape的CytoNCA插件對“成分-靶點網絡”進行拓撲分析，首先計算出Degree值中位數為33，然后篩選出度值大于中位數2倍的節點，為1 098個靶點的網絡(見圖6)，為增加富集度，繼續通過CytoNCA插件對1 098個靶點的網絡進行拓撲分析，計算出Degree值中位數為71，然后篩選出度值大于中位數2倍的節點為159個作為核心成分靶點網絡節點，最后構建“核心成分-靶點網絡”(見圖7)，其中包括159個疾病靶點和11個活性成分。

圖5 成分-靶點網絡

圖6 1098個靶點的網絡

圖7 核心成分-靶點網絡

2.4 KEGG富集通路信息 利用David對159個靶點進行GO基因注釋，通過高級氣泡圖進行可視化(見圖8)。對159個靶點進行KEGG富集分析，得到20條信號通路(見圖9)，橫坐標表示富集因子，縱坐標表示通路，圓點顏色代表P值，顏色越鮮艷，則P值越小，基因在此通路上的富集顯著性越高；圓點大小表示基因數，越大則富集基因數越多。圖8為顯著性前20的富集結果，包括基因表達負調控-表觀遺傳、端粒組織、DNA復制依賴核小體組裝、蛋白質異源四聚體、rDNA染色質沉默、基因表達的正調控-表觀遺傳、細胞蛋白代謝過程、核轉錄的mRNA分解代謝過程-無意義介導的衰變、SRP依賴的靶向膜共轉化蛋白、核小體組裝、翻譯啟動、病毒轉錄、RNA基因沉默、β-連環蛋白TCF復合物裝配、端粒封頂、巨核細胞分化負調控、非同源端接雙股斷裂修復、翻譯、rRNA處理、與DNA復制無關的核小體組裝等?；騅EGG通路富集分析(見表2)發現黃連治療心房顫動主要通過酒精中毒、核糖體、細胞周期、泛素介導的蛋白質水解、甲狀腺激素信號通路、拼接體、雌激素信號通路、Epstein-Barr病毒感染、PI3K-Akt信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、低氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路、DNA復制、內質網蛋白質加工、粘合連接、核苷酸切除修復、Notch信號通路、抗原處理和呈現、卵母細胞減數分裂、結節樣受體信號通路、非同源末端連接等方面干預心房顫動。每條通路涉及的基因見表3。

圖8 159個成分靶點GO注釋生物過程氣泡圖

圖9 159個成分靶點富集通路氣泡圖

編號 通路名稱基因數百分比(%)hsa05034Alcoholism(酒精中毒)3018.867 924 53hsa03010Ribosome(核糖體)2616.352 201 26hsa04110Cell cycle(細胞周期)1610.062 893 08hsa04120Ubiquitin mediated proteolysis(泛素介導的蛋白質水解)159.433 962 264hsa04919Thyroid hormone signaling pathway(甲狀腺激素信號通路)127.547 169 811hsa03040Spliceosome(拼接體)127.547 169 811hsa04915Estrogen signaling pathway(雌激素信號通路)106.289 308 176hsa05169Epstein-Barr virus infection(Epstein-Barr病毒感染)116.918 238 994hsa04151PI3K-Akt signaling pathway(PI3K/-Akt信號通路)1911.94 968 553hsa04010MAPK signaling pathway(MAPK信號通路)159.433 962 264hsa04066HIF-1 signaling pathway(HIF-1信號通路)85.031 446 541hsa03030DNA replication(DNA復制)53.144 654 088hsa04141Protein processing in endoplasmic reticulum(內質網蛋白質加工)106.289 308 176hsa04520Adherens junction(粘合連接)63.773 584 906hsa03420Nucleotide excision repair(核苷酸切除修復)53.144 654 088hsa04330Notch signaling pathway(Notch信號通路)53.144 654 088hsa04612Antigen processing and presentation(抗原處理和呈現)63.773 584 906hsa04114Oocyte meiosis(卵母細胞減數分裂)74.402 515 723hsa04621NOD-like receptor signaling pathway(結節樣受體信號通路)53.144 654 088hsa03450Non-homologous end-joining(非同源末端連接)31.886 792 453

表3 20條通路基因信息

3 討 論

我國2019年中國心血管病報告提出，中國≥35歲居民的心房顫動患病率為0.71%，極大地危害病人的健康[7]。目前，心房顫動的西醫治療方法可分為“節律控制”“室率控制”，主要干預手段為抗心律失常藥物和射頻消融術[8]，但存在抗心律失常藥物藥理機制復雜、遠期致心律失常作用、手術需嚴格適應證等不足[9]。心房基質重構和電重構是心房顫動發生和維持的關鍵病理機制，心房纖維化是心房基質重構的重要表現形式，心房纖維化或炎癥等病理學改變導致的心房擴張，會加重心房纖維化的進程進一步誘發心房顫動，同時，心房纖維化和心房擴張也能導致心房電功能的改變，造成惡性循環[2]。心房顫動已成為心血管領域防治的重點和難點，開發新的有效治療措施具有重要意義。

心房顫動臨床多以心慌為主癥，屬中醫“心悸”范疇，其基本病機不外虛實兩個方面，虛者為氣血陰陽虧損，心神失養所致；實者則多由痰熱、水飲、瘀血等實邪所致[10]。隨著現代生活水平的提高，飲食結構的調整，肥甘厚味極易傷及脾胃，以致脾失健運，痰濕內生，郁而化熱，痰熱內擾，心神不安，而致心悸，表現為心慌間斷發作、胸悶、口苦、煩躁失眠等癥狀[11]。針對心房顫動痰熱擾心的病機，現代醫家多加用黃連以發揮清心降火功效。目前黃連廣泛應用于心血管系統疾病治療，特別是在防治快速性心律失常方面。既往臨床研究證實，含黃連方劑可有效改善快速型心律失常疾病癥狀，防止疾病的進展[12-16]。課題組前期臨床實踐表明，含黃連方劑參連復脈顆粒具有益氣活血、清心化痰、安神復脈功效，其中黃連苦寒入心經，為臣藥，具有清心降火、安神止悸之功[17]?，F代藥理研究表明，黃連中多種活性成分具有抗心律失常作用[18]，如小檗堿、巴馬汀等[19-22]，機制可能與其延長動作電位時間和有效不應期、改善心肌缺血狀態、阻斷α-受體、改善炎癥狀態等多方面有關[23]。

本研究通過網絡篩選得到黃連活性成分和心房顫動疾病靶點，分別構建成分和疾病靶點的PPI網絡，通過Merge分析，得到藥物-疾病共同相關的核心靶點可視化網絡并進行富集通路分析，結果顯示有11個活性成分可以直接或間接作用于159個靶點，5 106條邊，涉及20條疾病通路，其中針對心房顫動有效的黃連活性成分主要包括小檗堿、小檗紅堿、巴馬汀等，它們可能通過調節基因表達、蛋白代謝、巨核細胞分化等生物過程及PI3K-Akt、MAPK、HIF-1、Notch等信號通路來發揮治療心房顫動的作用。

中藥成分復雜多樣，能夠作用于多個靶點、多條通路，通過君、臣、佐、使的配伍原則作用于疾病，從而實現中藥對機體的整體調控，明確其藥效物質及作用機制，將更有利于推進中醫藥的現代化進程[24]。黃連清心降火、安神止悸，臨床用于痰熱擾心證的心房顫動，療效明確。從黃連成分-靶點網絡圖中可以看出，同一活性成分可作用于不同靶點，不同活性成分也可作用于相同靶點，體現出黃連多成分、多靶點治療疾病的作用特點，從PPI網絡可看出，靶點之間的關聯情況復雜，數目眾多。由此可見，黃連多成分、多靶點、蛋白靶點之間關聯作用的特點，可為解釋其異病同治的作用機制提供參考。

本研究通過網絡藥理學方法分析黃連活性成分及心房顫動靶點之間的關系，發現黃連活性成分小檗堿、小檗紅堿等可能通過抑制基因表達、抑制巨核細胞分化、抗蛋白代謝等途徑共同發揮抗心房顫動的作用。本研究初步探索和預測了黃連治療心房顫動的藥效物質基礎與分子生物學機制，為后續實驗研究進一步驗證其作用機制提供了依據。