慢性心力衰竭大鼠腦血流量變化及其一氧化氮合酶作用機制

陸梓雯，趙明鏡，王 蕾，楊 濤，趙一舟，仇 琪，成文堃，李 彤，王保福，楊京京，李 洋，蔣洋洋

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)作為最常見的心血管疾病之一，是各種心臟疾病的嚴重表現或晚期階段，全世界至少2 600萬人的健康受到影響[1]。在我國35～74歲人群中，心力衰竭的患病率為0.9%，病人住院病死率為4.1%，其死亡率仍遠高于其他疾病，成為社會重大的公共衛生問題[2]。相關研究表明，25%～85%的慢性心力衰竭病人?；加胁煌潭鹊恼J知功能障礙，如記憶能力、學習能力和注意力下降，執行功能差等[3-4]。心力衰竭和認知功能障礙疊加會增加病人的住院率和死亡率，心力衰竭伴有認知障礙的病人中因病情惡化而重復住院的概率比心力衰竭不伴認知障礙的病人高26%[5]。然而關于心力衰竭后認知功能障礙的病理生理機制尚不清楚。一些臨床研究認為，心力衰竭后病人腦血流量下降可能與認知功能障礙有關[6]，然而也有研究顯示心力衰竭后腦血流量并沒有變化[7]，因此對于心力衰竭后腦血流的變化仍不確定。同時考慮到臨床結果受到多種疾病和危險因素的干擾，因此采用疾病單純的動物模型，觀察心力衰竭后腦血流的變化和研究相關機制非常必要。中醫理論認為“心主神明”，現代醫學也認為心的功能會影響腦的生理功能[8]。本研究通過建立大鼠心肌梗死后心力衰竭模型，探討心力衰竭后腦血流量的變化及其相關的機制，為中醫“心主神明”理論提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物及飼養 雄性SD大鼠30只，體重230～240 g，購于北京維通利華實驗動物中心，許可證編號SCXK(京)2019-0009，分籠飼養于北京中醫藥大學東直門醫院屏障級動物房[室溫(24±1)℃，濕度(60±10)%]。每天提供給大鼠標準的飼料與飲用水。

1.2 儀器 小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)；心電圖機(上海醫學電子儀器廠)；超高分辨率小動物超聲成像系統(加拿大Visual Sonics公司，探頭型號MS-201)；Morris水迷宮實驗系統(上海欣軟科技有限公司)；激光散斑多普勒血流儀(瑞典PERIMED公司)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 試劑 內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抗體(美國Abcam公司，貨號：ab5589)；誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗體(美國Abcam公司，貨號：ab3523)；羊抗兔IgG多克隆抗體(北京普利萊基因技術有限公司，批號 C1309-100)。

1.4 動物心肌梗死后心力衰竭造模[9]將大鼠隨機分為假手術組和模型組。動物稱重后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行麻醉，胸部皮膚備皮，固定于鼠板上。經口腔行氣管插管術，連接呼吸機，觀察動物呼吸情況。沿大鼠胸骨左側3～4肋間切開皮膚，打開胸腔。輕輕提起心耳，在肺動脈圓錐與心耳之間，心耳邊緣下2～3 mm，結扎左冠狀動脈前降支。關閉胸腔依次分層縫合肋骨、肌肉和皮膚，移除呼吸機，觀察動物呼吸情況。動物術后連續3 d腹腔注射青霉素，每天4×105U。假手術組只穿線不結扎。動物手術死亡率約為20%，每組12只大鼠。

1.5 超聲檢測和心電圖檢測 動物經1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，行十二導聯心電圖檢測。心電圖檢測分別在術前、術后即刻和術后第60天進行。超聲心動檢測于術后第60天進行，使用15 MHz高頻探頭，取左室乳頭肌短軸切面及左室長軸切面，二維超聲引導下，測定射血分數(ejection fraction，EF)和短軸縮短率(fractional shortening，FS)。

1.6 Morris水迷宮行為學檢測 應用Morris水迷宮評價動物認知功能[10]。水迷宮圓形水池直徑160 cm，水深27 cm，水溫(24±1)℃，池內有一直徑為12 cm的圓形平臺，低于水面1.5 cm，作為大鼠逃生的平臺。房間四周有五角星、三角形等形狀作為提示線索。水迷宮分為S、N、W、E 4個入水點。

1.6.1 定向航行實驗 平臺位于SW象限，首先將大鼠置于平臺上5 s中，使其熟悉周圍環境，然后將大鼠從其余3個入水點隨機面壁放入水池中，其尋找平臺時間限定為120 s，如果大鼠沒有在120 s內找到平臺，則實驗者將大鼠放置于平臺上5 s以加強記憶。每天3次，連續3 d。記錄大鼠平均潛伏期與路程，沒有找到平臺大鼠的潛伏期按120 s記錄。

1.6.2 穿臺實驗 在定向航行實驗24 h后，撤去平臺，將大鼠面壁放入水池中，限定時間為120 s。記錄其穿越平臺位置的次數。認知評價后，每組8只動物做腦血流檢測，另外每組4只動物進行其他檢測。

1.7 腦血流檢測 動物經1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后20 min，俯臥，固定頭部，剔除頭頂部皮毛，剪開皮膚，使用鈍刀片去除顱骨周圍軟組織，使其暴露出顱骨。根據腦定位圖譜，前囟右側旁開5 mm、下3 mm定位右側頂葉感興趣區。使用牙科鉆制作骨窗，將顱骨打磨薄，可隱約看到大腦皮質。腦血流儀監測感興趣區血流量，監測距離18.9 cm，監測時間5 min。腦血流檢測后處死動物取材。

1.8 Western Blot法檢測 提取腦組織蛋白，每組4只，測定濃度。將提取樣品緩慢加入凝膠上樣孔中，使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，設定電壓200 V電轉2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗，4 ℃過夜。TBST洗膜，孵育二抗1 h，洗膜，發光。使用Image J軟件分析灰度值。

2 結 果

2.1 兩組大鼠心電圖結果比較 模型組大鼠術后第60天心電圖Ⅰ、aVL、V1～V6出現明顯的病理性Q波(見圖1B2)，說明心力衰竭大鼠有透壁性心肌梗死。術后第60天取材可見，心力衰竭大鼠的左心室前壁心肌組織被纖維結締組織取代，形成室壁瘤。詳見圖1B1。而假手術組的心電圖和心臟均正常(見圖1A1、圖1A2)。

A1、A2為假手術組；B1、B2為模型組

2.2 兩組大鼠心臟超聲結果比較 假手術組大鼠心室收縮運動呈現M型波，而心力衰竭大鼠的前壁波形變平、變直，甚至消失，說明心力衰竭大鼠心室運動減弱。模型組EF值和FS值較假手術組明顯下降(P<0.05)。詳見表1、圖2。

%

與假手術組相比，1)P<0.05

假手術組 模型組

2.3 心力衰竭大鼠腦認知功能評價結果

2.3.1 兩組大鼠定向航行實驗結果比較 模型組和假手術組大鼠在第1天、第2天、第3天的定向航行實驗中，平均潛伏期、總路程、游泳速度比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2～表4。

表2 兩組大鼠平均潛伏期比較(±s) s

表3 兩組大鼠平均總路程比較(±s) cm

表4 兩組大鼠游泳速度比較(±s) cm/s

2.3.2 兩組大鼠穿臺次數比較 在穿臺實驗中，模型組大鼠穿越平臺的次數明顯低于假手術組(P<0.01)，說明心力衰竭大鼠的空間記憶能力明顯受損。

表5 兩組大鼠穿越平臺次數比較(±s) 次

與假手術組相比，1)P<0.01

2.4 兩組大鼠腦血流灌注量比較 與假手術組相比，模型組大鼠腦部血流灌注量差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表6和圖3。

表6 兩組腦部血流灌注量比較(±s) PU

假手術組 模型組白色圓圈所示為感興趣區數值測量范圍

2.5 兩組大鼠腦組織中eNOS和iNOS表達含量 與假手術組比較，模型組大鼠大腦皮質中eNOS的相對表達量有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，而iNOS的相對表達量無明顯變化。詳見圖4。將大鼠腦組織中eNOS與iNOS的相對表達量作比值，發現心力衰竭大鼠eNOS/iNOS比值的相對表達量明顯低于假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖5。

S：假手術組；M：模型組圖4 兩組腦組織eNOS和iNOS表達量比較

與假手術組相比，*P<0.05圖5 兩組eNOS/iNOS比值的相對表達量比較

3 討 論

臨床上慢性心力衰竭病人常伴有不同程度的認知功能障礙，嚴重影響病人的生存質量并增加重復住院率及死亡率。關于心力衰竭后所引起認知功能障礙的病理機制尚不明確。一些研究認為腦部血流量的降低可能是影響心力衰竭后認知功能障礙的主要原因，然而另一些研究結果相互矛盾[11-12]。本研究發現，盡管eNOS與iNOS比值明顯降低，但慢性心力衰竭大鼠腦血流量并未發生明顯的變化。

本研究采用左側冠狀動脈前降支結扎術造成心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，結果可見，模型組大鼠心電圖出現病理性Q波，且心臟超聲EF和FS值明顯降低，說明模型組大鼠心功能明顯降低，符合心力衰竭的診斷。在認知功能評價中，心力衰竭大鼠的穿越平臺的次數明顯降低，表明心力衰竭大鼠存在明顯的記憶功能障礙，這也與臨床心力衰竭病人的情況相似。

有效腦血流量是正常腦功能的前期，關于心力衰竭后腦血流的變化還存在很多的爭議。Roy等[12]研究表明，心力衰竭病人腦血流量往往是明顯減少的[13]，主要集中在額葉、頂葉、顳區、小腦等腦區。研究認為造成心力衰竭后腦血流量降低的首要原因是心排出量降低導致心肌缺血缺氧改變了腦組織以及血管的結構；其次由于受到神經體液調節系統和腎素-血管緊張素系統的影響，大腦的自主調節能力降低[14]。此外，臨床心力衰竭病人常伴有高血壓、血脂異常等疾病，其內皮功能常受損和血管代償能力差，也可能造成腦血流降低。然而，另一些學者的研究又出現了不同甚至相反的結果。Erkelens等[7]認為心力衰竭病人全腦的血流灌注量并沒有發生變化，認為其是毛細血管前動靜脈吻合來應對靜脈壓力升高的代償機制保證腦區的血流并沒有發生變化。Mansur等[11]研究表明，心力衰竭后腦血流量變化是增加的，這種增加的主要原因可能是因為心力衰竭急性期引起機體產生多種代償機制，如血壓升高、心率加快、血漿去甲腎上腺素水平升高，進而引起了局部血流量的增加。由此可見，腦血流這些矛盾的結果可能與研究對象的合并癥、疾病的程度及疾病的不同階段有關。本研究發現，與假手術組比較，心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠的腦血流灌注量變化不明顯。產生這種現象的可能原因：首先該模型是心肌梗死后心力衰竭的慢性階段；其次動物疾病模型較單純，與臨床病人相比沒有高血壓、高血脂等混雜因素的影響；另外機體有強大的代償功能，神經體液等一系列的調節作用可能在維持機體的腦血流穩定中發揮重要作用。

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)主要存在于血管內皮細胞和神經系統中，主要作用是合成一氧化氮(nitric oxide，NO)，其有3種同工酶。與血管收縮和舒張相關的主要是eNOS和iNOS。正常情況下主要以eNOS為主，以eNOS來源的NO具有保護內皮和擴張血管作用，也有神經保護作用；而損傷后誘導表達的iNOS，其來源的NO會加重氧化應激，損傷內皮細胞功能，同時可介導遲發型神經損傷。而eNOS/iNOS比值的降低可反映內皮功能受損和功能下降[15-16]。本研究發現，慢性心力衰竭大鼠的大腦皮質eNOS表達含量有下降趨勢，eNOS/iNOS明顯降低，提示心力衰竭大鼠的內皮功能受損和功能障礙。但盡管如此，由于機體的代償功能仍然可以保持整體腦部血流量處于正常范圍。

雖然心力衰竭后大鼠的腦血流量變化并不明顯，但心力衰竭大鼠仍存在明顯的記憶能力下降等認知功能障礙表現，根據現有文獻分析，可能與以下因素有關。心力衰竭時心臟分泌大量的炎性細胞因子，其可通過改變神經可塑性和抑制學習和記憶相關的神經傳導來降低動物的認知功能[17]。此外，心力衰竭時缺氧所導致的氧化應激反應會引起淀粉前體樣蛋白的增加進而導致記憶功能衰退[18]。本課題之前的研究也發現慢性心力衰竭階段腦葡萄糖代謝明顯降低。

本研究通過結扎左冠狀動脈前降支制作心肌梗死后慢性心力衰竭模型，評價其認知功能和大腦血流量變化，發現慢性心力衰竭大鼠存在明顯的認知功能障礙，主要表現為記憶力下降。盡管慢性心力衰竭大鼠NOS系統異常、內皮功能障礙，但其腦部血流量變化并不明顯。提示心臟對腦功能的影響是一個復雜的過程，血流只是影響因素之一，即使腦血流沒有變化，慢性心力衰竭大鼠仍出現了認知功能損害。因此，心臟對大腦影響的研究還需要新的視角和新的方法，才能闡明心血管疾病導致認知功能障礙的病理機制，也為中醫“心主神明”理論提供科學依據。