基于液質聯用技術采用正交設計優選制川烏單酯型生物堿醇提工藝

周長凱，徐 文，高 靜，曹銘晨，紀洪艷，姚景春，張 娜，劉永軍，荊凡波*

（1.青島大學附屬醫院，山東 青島 266100；2.青島市第三人民醫院，山東 青島 266041；3.魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 273400；4.山東大學 藥學院，山東 濟南 250012）

川烏為毛茛科植物烏頭的干燥母根，制川烏為川烏的炮制加工品，其味辛、苦，熱，有毒。歸心、肝、腎、脾經，具祛風除濕、溫經止痛之功效，具極高的藥用價值?，F代研究證實，川烏具有抗炎、抗腫瘤、調節免疫、鎮痛[1-4]等藥理作用，但因其毒性，川烏臨床應用受極大限制。雙酯型生物堿為其川烏的主要毒性成分，經炮制后，可轉化為單酯型生物堿，毒性為雙酯型生物堿的0.002～0.005[5-7]，在保持藥理活性的同時安全性得到極大提升，具有廣闊的應用前景。然而，目前尚無制川烏提取物相關制劑，且對其單酯型生物堿的提取相關研究極為匱乏，本試驗擬采用正交試驗優化制川烏單酯型生物堿醇提工藝，以期為工業化大生產及新制劑研發提供數據支持。

1 儀器、藥品與試劑

API4000+三重四極桿串聯質譜系統，Agilent 1290II高效液相色譜儀。苯甲酰新烏頭原堿，苯甲酰次烏頭原堿，苯甲酰烏頭原堿對照品由上海一林生物科技有限公司提供。制川烏飲片購自藥材市場。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 液相色譜分析條件

色譜柱：Ultimate AQ-C18柱（2.1 mm×100 mm，3.0 μm，上海月旭科技有限公司），柱溫40 ℃，流速：0.4 ml/min。流動相：0.1 %甲酸水-甲醇=55:45。

2.2 質譜分析條件

電噴霧電離離子源，源電壓5.5 kV，毛細管溫度為550 ℃，鞘氣流速40，正離子檢測，質量分析器為四級桿，采用MRM模式檢測，檢測條件與MRM圖分別見表1、圖1。

表1 MRM條件表

圖1 苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的MRM圖

2.3 供試品溶液的制備

取制川烏中粉10 g置于圓底燒瓶中，加75 %乙醇250 ml，加熱回流提取1 h，提取液定容至250 ml，濾過，取續濾液，即得。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿對照品各10 mg，分別置10 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，即得。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 分別將苯甲酰新烏頭原堿（1 mg/ml）、苯甲酰次烏頭原堿（1 mg/ml）、苯甲酰烏頭原堿（1 mg/ml）溶液稀釋1000，2000，5000，10 000，20 000和50 000倍，依次注入液-質色譜儀，記錄峰面積。分別以進樣量(ng)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，苯甲酰新烏頭原堿回歸方程為：Y=2.92×103X+1.31×102，r=0.9995；苯甲酰次烏頭原堿回歸方程為：Y=4.37×103X+1.55×102，r=0.9998；苯甲酰烏頭原堿回歸方程為：Y=1.12×103X-1.05×102，r=0.9996。結果表明, 苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿在20～1000 ng范圍線性關系良好。

2.5.2 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液10 μl，連續進樣6次，記錄峰面積。結果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿峰面積RSD值分別為1.46 %，1.27 %，1.19 %，表明儀器的精密度良好。

2.5.3 穩定性試驗 按2.3項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10 h進樣，記錄峰面積。結果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的峰面積RSD值分別為1.14 %，1.35 %，1.27 %（n=6），表明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.5.4 重復性試驗 按2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，分別精密吸取10 μl進樣測定。計算得到供試品中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿含量RSD值分別為1.26 %，1.32 %，1.13 %，表明方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收試驗 取9份已知含量的供試品，每份約1.00 g，精密稱定，分別精密加入3種對照品的量相當于供試品中含各對照品量的80 %，100 %，120 %，每個水平平行3份。按2.3項下方法制備供試品溶液。按2.1、2.2項下條件進行測定，記錄色譜峰面積，計算單酯型生物堿含量（以苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿之和計）、加樣回收率及RSD值，見表2。結果表明，3種濃度的平均加樣回收率為100.9 %，101.5 %，101.9 %，RSD值為1.21 %，1.86 %，2.50 %。

表2 加樣回收試驗結果

2.5.6 定量限與檢測限考察 取2.4項下的對照品溶液適量，倍比稀釋，按2.1項和2.2項的條件連續測定6次，記錄峰面積。以最低定量限和檢出限信噪比S/N=10和S/N=3為原則，計算定量限為與檢測限分別為0.0200，0.0065 μg/ml。

2.6 單因素試驗

2.6.1 提取次數對單酯型生物堿含量的影響 取制川烏中粉10 g，置入圓底燒瓶，加75 %乙醇250 ml，回流提取1 h，提取液定容至250 ml，濾過。殘渣；參照第一次的處理方法，分別提取2次。測定3個樣品中單酯型生物堿含量，結果見圖2。

圖2 不同提取次數單酯型生物堿含量

2.6.2 粉碎粒度對單酯型生物堿含量的影響 分別取制川烏飲片、粗粉、中粉、細粉各10 g，置入圓底燒瓶，加75 %乙醇250 ml，回流提取1 h，提取液定容至250 ml，濾過，取續濾液，測定樣品中單酯型生物堿含量，結果見圖3。

圖3 不同粉碎粒度單酯型生物堿含量

2.6.3 乙醇濃度對單酯型生物堿含量的影響 取制川烏中粉10 g，置入圓底燒瓶，分別加35 %，55 %，75 %，95 %乙醇250 ml，回流提取1 h，提取液定容至250 ml，濾過，取續濾液，測定樣品中單酯型生物堿含量，結果見圖4。

圖4 不同乙醇濃度單酯型生物堿含量

2.6.4 乙醇倍量對單酯型生物堿含量的影響 取制川烏中粉10 g，置入圓底燒瓶，分別加75 %乙醇50，150，250，350，450 ml回流提取1 h，提取液定容至500 ml，濾過，取續濾液，測定樣品中單酯型生物堿含量，結果見圖5。

圖5 不同乙醇倍量單酯型生物堿含量

2.6.5 提取時間對單酯型生物堿含量的影響 取制川烏中粉10 g，置入圓底燒瓶，加75 %乙醇250 ml，分別回流提取0.5，1，1.5，2，2.5 h，提取液定容至500 ml，濾過，取續濾液，測定樣品中單酯型生物堿含量，結果見圖6。

2.7 正交試驗

圖6 不同提取時間單酯型生物堿含量

2.7.1 正交試驗表 根據單因素試驗結果，提取2次已把目標成分提取完全，第3次提取量僅為前兩次總和的0.86 %，故固定提取次數為2次。粉碎粒度方面，細粉較中粉目標成分含量升高僅0.93 %，綜合考慮生產可操作性與成本，選擇粒度為中粉。乙醇濃度方面，隨著乙醇質量分數的升高成分含量逐漸升高，至75 %時含量最高，此濃度下目標成分溶解性高，95 %時含量出現顯著下降，故選擇鄰近濃度65 %，75 %，85 %為正交試驗因素水平。溶劑倍量方面，隨提取體積增大成分含量逐漸升高，25倍量（250 ml）時已提取較充分，35，45倍時含量無明顯增加，故選擇15，25，35倍作為正交試驗因素水平。提取時間方面，當提取1.5 h時成分含量最高，提取較完全，2 h時開始下降，長時間加熱可能會使單酯型生物堿進一步水解，故選擇1，1.5，2 h為正交試驗因素水平。

表3 正交因素水平表

2.7.2 正交試驗結果

由表4可知，極差RA＞RC＞RB，即影響因素主次順序為：乙醇濃度＞提取時間＞乙醇倍量。從表5方差分析結果表明，對于目標成分的提取，乙醇濃度影響顯著，提取時間和乙醇倍量有一定影響。根據k值進行分析，得到最優工藝為A2B2C3，但C3的單次提取時間為2 h，時間偏長，且提取效果非顯著優于C2水平，綜合考慮生產實際、環保等因素，確定A2B2C2為最佳工藝，即乙醇濃度75 %，乙醇倍量25倍，每次提取1.5 h。

表4 L9(34)正交試驗

表5 方差分析表

2.8 工藝驗證性試驗

為驗證所得組合工藝的可行性，進行了3批驗證試驗，按優選工藝進行提取，測定苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿，結果見表6?？梢?，驗證試驗的平均值為12.87，RSD為1.91 % (n= 3)，表明正交試驗優選的條件穩定可行，可作為制川烏單酯型生物堿的提取工藝。

表6 驗證性試驗結果

3 討論

中藥川烏中二萜生物堿為其主要的化學成分，也是川烏的主要藥效成分，以 C-19二萜生物堿為主，包括烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等有毒的雙酯型生物堿，其經過炮制可成為低毒的單酯型生物堿如苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿等，從而達到增效減毒的目的，使制川烏的臨床使用安全性得到極大提升，但是針對制川烏單酯型生物堿的提取、藥理及機制相關研究相對匱乏，以致市面上仍無制川烏提取物的相關制劑，因此未來制川烏新制劑的開發創制具有廣闊的市場空間。

在正交試驗目標成分的選擇上，制川烏中主要含有單酯型生物堿，雙酯型生物堿含量相對較低，且2015年版中國藥典對烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿3種雙酯型生物堿含量之和設定上限不得過0.04 %，本試驗參考藥典含量測定項，選取苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿3種單酯型生物堿特征成分為指標成分，以含量之和記為單酯型生物堿含量，作為工藝優選的指標。在提取方法上，我們通過預實驗發現在未調pH情況下，本研究所用醇提法較之藥典提取法，對指標成分的提取率更高，醇提法亦更適于工業化生產。此外，在提取過程中發現目標成分含量較低，且3種成分的含量相差很大，苯甲酰烏頭原堿含量極低，在預實驗中出現過未檢測出的情況，但在工藝優選后，其含量較穩定，優化后提取工藝簡單、可靠，對日后制川烏的深入開發以及單酯型生物堿新制劑的工業化生產具有一定的參考意義。