乳粉中糖類的色譜及質譜檢測方法研究進展

李 莉，薛偉鋒*，曹文軍

（1.大連市檢驗檢測認證技術服務中心，遼寧 大連 116600；2.大窯灣海關技術中心，遼寧 大連 116600；3.中檢（大連）測試技術有限公司，遼寧 大連 116600）

糖類作為乳粉中一類重要的營養成分，對人體起著至關重要的作用，如乳糖經乳糖酶作用后轉化為有機酸，能夠有效促進鈣離子的吸收。另外，腸道健康也得益于乳糖對有益菌生長的促進作用。但有時乳糖也會起到反作用，如乳糖對某些體內缺乏乳糖酶的乳糖不耐受者危害很大，由于乳糖消化吸收功能受阻，乳糖不耐受者可能出現腹瀉和腹痛等癥狀[1]。蔗糖雖然可以提高乳粉含糖量，但過量食用則會導致蛀牙和肥胖等。功能性低聚糖在嬰幼兒乳粉中作用顯著，不僅能促進嬰幼兒腸道有益菌群繁殖，還能增強免疫力，提高腸道防御功能，預防感染性腹瀉，改善功能性便秘[2-7]。國家標準也對嬰幼兒食品中功能性糖類物質的添加量進行了規定，如GB 14880—2012《食品安全國家標準 食品營養強化劑使用標準》[8]規定，作為營養強化劑添加到嬰幼兒配方食品中的功能性糖類物質總含量不得超過64.5 g/kg。盡管添加低聚糖的嬰幼兒配方乳粉是乳粉行業的一大亮點，但也存在低聚糖添加量極少的尖銳問題。因此，建立乳粉中糖類的檢測方法至關重要，掌握乳粉中糖含量對于了解乳粉品質和指導消費者具有重要意義。

目前，糖類的分析方法主要有酶解法[9]、氣相色譜（gas chromatography，GC）法、氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[10-11]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[12-13]、離子色譜（ion chromatography，IC）法[14-16]和液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法等[17-19]。色譜及質譜分析方法已經成為糖類檢測的最主要手段，本文在總結已有研究的基礎上，結合近年研究動態，綜述乳粉中糖類檢測的色譜及質譜分析方法研究進展，方便科研人員選擇合適的糖類檢測方法。

嬰幼兒乳粉基質復雜，所含糖種類多且含量差異大，因此對分離條件要求較高。盡管GC和GC-MS法對糖類的分析靈敏度較高且分離效果好，但存在樣品前處理步驟復雜的問題，尤其是對某些分析物需進行衍生化反應。HPLC法受到檢測器的影響，對糖類的分析靈敏度相對較低。結合優化的梯度洗脫程序的IC-電化學檢測法[20-21]在糖類分析中表現出分離效果好、靈敏度高和選擇性強等特點[22-23]，已被美國分析化學家協會等機構廣泛應用于食品分析檢測中[24]。針對復雜的乳粉樣品基質，高分辨質譜在靈敏度和抗干擾能力方面表現出優勢，成為未來乳粉中糖類檢測方法的重要發展趨勢[17-19]。本文針對上述幾種方法重點闡述乳粉中糖類檢測方法的研究進展。

1 GC法

孫曼澤等[25]采用GC法測定乳粉中的乳糖和蔗糖，測定乳糖的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為4.52%，回收率為94%～104%，測定蔗糖的RSD為4.35%，回收率為97.7%～102.3%；另外，根據GB 5413—1985《乳粉檢驗方法》[26]中的方法測得乳粉中的乳糖含量為30.5%，蔗糖含量為19.6%，2 種方法的相對誤差分別為0.66%和1.50%，表明用GC法測定乳粉中的乳糖和蔗糖操作簡便、分析速度快、準確度高，可以作為乳粉中乳糖和蔗糖含量的測定方法。但GC法需要對樣品進行衍生化反應，反應條件較為苛刻。Block等[27]采用GC法測定11 批脫脂牛乳中異構化乳糖的含量，結果表明，GC法對于脫脂乳中異構化乳糖的檢測限為50 mg/L。Montilla等[28]利用對位取代苯酚氧苷作為內標，建立乳制品中異構化乳糖含量的GC測定法，并采用該方法檢測27 份商業牛乳樣品，回收率為89.6%～110.6%。

2 HPLC法

HPLC是糖類檢測的重要手段，在對樣品進行前處理后，選取不同的色譜柱和流動相，通過示差折光檢測器或蒸發光散射檢測器對糖類進行分析。例如，黃紅霞[29]應用HPLC對乳粉及調制乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖進行測定，將樣品經簡單的前處理后由碳水化合物分析柱分離，以乙腈/水為流動相，采用示差折光檢測器進行檢測，結果表明，乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖能夠完全分離，回收率為100.4%～106.1%，RSD＜0.9%，線性相關系數（R2）在0.998 3以上，證明該方法能夠簡便、快速測定乳粉及調制乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖。吳莉等[30]使用HPLC對乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖進行測定時發現，樣品經簡單的預處理后，采用Spherisorb NH2色譜柱（0.46 cm×25 cm，7 μm）分離，以乙腈/水（體積比7∶3）為流動相，流速1 mL/min，采用示差折光檢測器檢測，3 種糖類能夠完全分離并定量，R2達0.999，回收率為99.98%～105.10%，RSD＜0.6%，證明采用HPLC法能夠對乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖進行快速、準確測定，方法簡單易行。郭秀春等[31]選用市售同種品牌不同年齡段的乳粉，通過HPLC-示差折光檢測器法對其乳糖和蔗糖含量進行測定，結果表明，蔗糖和乳糖的線性范圍均為2～12 mg/mL，R2分別為0.999 3和0.999 6，RSD分別為2.53%和3.81%，平均加樣回收率分別為99.70%和101.06%，該方法測定結果準確、分析時間短、前處理簡單，適用于快速測定乳粉中的蔗糖和乳糖含量。Wang Xinmin等[32]建立了一種HPLC-示差折光檢測器分析配方乳粉中氨基葡萄糖和乳糖的簡單方法，樣品在進行HPLC分析前經過蛋白質沉淀凈化，采用昭和電工Asahipak NH2P-50柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離，流動相為乙腈 -水（體積比7∶3），結果表明，該方法具有很好的線性（R2均大于0.99）、靈敏度（檢出限分別為0.11、0.13 mg/mL，定量限分別為0.21、0.23 mg/mL）、精密度（RSD分別為1.26%和1.06%）和回收率（分別為96.5%～98.2%和97.1%～98.0%），整個分離過程在10 min內即可完成，該方法可以達到快速、簡便檢測乳粉中糖類的目的。

那紅萍等[33]采用HPLC法，以資生堂UG80S5柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為分析柱，示差折光檢測器檢測，1 次進樣同時測定乳粉低聚果糖中的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖，結果表明，3 種糖的回收率為98.8%～105.9%，RSD為0.20%～0.26%，最低檢出限為微克級。陳小英等[34]采用HPLC法同時測定乳粉中的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖，采用Agilent NH2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈 -水（體積比7∶3），示差折光檢測器檢測，結果表明，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖質量濃度分別在0.305 0～6.100 0、0.405 4～8.108 0、0.245 7～4.914 0 mg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，R2均在0.999 5以上，3 種物質的加樣回收率平均值分別為96.1%、100.3%和100.0%，RSD分別為1.5%、2.9%和3.3%，該方法簡便、準確、可靠，適用于乳粉中蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖3 種主要有效成分的測定。許彬等[35]采用HPLC法檢測乳粉中的低聚果糖，樣品經硫酸銅（質量濃度100 g/L）和氫氧化鈉（質量濃度40 g/L）去除蛋白后，采用氨基色譜柱分離，示差折光檢測器分析，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，流動相為乙腈/水（體積比7∶3），外標法定量，結果表明，蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖在一定質量濃度范圍內線性關系良好，添加回收率分別為99.1%、99.7%和95.3%，RSD分別為0.3%、1.1%和0.3%，檢出限分別為2、2、4 mg/kg，該方法快速靈敏、簡便、準確，適用于乳粉中低聚果糖的檢測。

Chávez-Serv?n等[36]建立一種HPLC-示差折光檢測器定性和定量分析配方乳粉中游離單糖和二糖（包括果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳果糖和乳糖）的簡單方法，結果表明，該方法具有很好的線性擬合系數（R2＞0.99），6 種糖的檢測限分別為0.17、0.13、0.06、0.16、0.05、0.25 mg/mL，定量限分別為0.27、0.24、0.20、0.26、0.22、0.38 mg/mL，果糖、蔗糖、乳果糖和乳糖的RSD分別為0.78%、0.99%、2.91%和0.46%，6 種糖的回收率為93%～113%。

除了HPLC-示差折光檢測器外，HPLC-蒸發光散射檢測器也常用于乳粉中糖類的檢測。例如，趙敏等[37]建立了一種同時測定嬰幼兒配方乳粉中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖的HPLC-蒸發光散射檢測器聯用技術，采用氨基柱分離，乙腈-水為流動相，梯度洗脫，結果表明，6 種功能性低聚糖得到很好分離，回收率為91.8%～102.0%，RSD＜3%（n=6），該方法能快速、準確、可靠地檢測嬰幼兒配方乳粉中功能性低聚糖的含量。孫久玉等[38]使用蒸發光散射檢測器測定配方乳粉中低聚果糖的含量，樣品用體積分數75%乙醇水溶液提取，通過旋轉蒸發將溶劑置換成50%乙腈水溶液，并通過C18固相萃取柱除去樣品中多余的脂肪類物質，進一步凈化樣品，采用Waters UPLC BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相采用乙腈和水，進行梯度洗脫，結果表明，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的檢出限均為20 mg/100 g，回收率在88.5%以上，RSD均小于1.5%，完全能夠滿足配方乳粉中低聚果糖的檢測要求。

3 IC法

采用IC法測定糖類已有較多報道，如測定蜂蜜和葡萄酒[39]、蜂蜜和蜂膠[40]以及茶葉[41]中的糖等。高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法[42-44]是近年來發展起來的一種測定糖類的有效方法，該方法具有前處理簡單、分離效果好和操作簡便等優點[45]，已被用于牛乳和乳制品中單糖和二糖的測定[46]。利用IC法同時測定乳粉中的多種糖類已經成為一種趨勢。

張水鋒等[47]建立梯度洗脫-IC-脈沖安培檢測技術，分析嬰幼兒配方乳粉中半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖和乳糖5 種與代謝疾病緊密相關的糖類。該方法對樣品的前處理、色譜柱、淋洗液梯度等色譜條件進行優化，重點研究淋洗液梯度對各組分分離效果的影響；將梯度洗脫程序分解為弱保留組分分離、乳糖分離、基質消除、系統平衡4 個子程序，并分別對其進行條件優化，實現了5 種組分的完全分離，并有效解決了弱保留組分色譜峰易重疊、乳糖色譜峰易拖尾等現象；5 種組分的線性范圍為0.5～100.0 mg/L，R2＞0.9 9，方法檢出限為0.0 6～0.4 0 m g/L；該方法具有分離度好、靈敏度高等優點，可滿足例行分析的要求，同時也為淋洗液的梯度優化提供了可借鑒的方法。熊建飛等[48]建立高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法測定乳粉中葡萄糖、蔗糖和乳糖的方法，以METROSEP CARB1陰離子交換柱（4.0 m m×1 5 0 m m，5 μ m）為分離柱，37 mmol/L氫氧化鈉溶液為淋洗液，以檸檬酸作為蛋白質沉淀劑，結果表明，葡萄糖、蔗糖和乳糖的線性范圍分別為1～40、1～50、1～50 mg/L，R2分別為0.996 6、0.996 8和0.998 5，檢出限分別為0.014、0.091、0.083 mg/L，RSD為1.10%～4.96%，回收率為90.13%～104.83%，該方法分析時間短、前處理簡單，適用于快速測定乳粉中的葡萄糖、蔗糖和乳糖。

冉丹等[49]建立以電化學脈沖安培-IC法檢測嬰幼兒配方乳粉中低聚半乳糖（galacto-oligosaccharide，GOS）含量的方法。首先采用IC法檢測經β-半乳糖苷酶酶解的原料糖漿試樣中GOS含量，再以測得GOS含量的同批次原料糖漿作為對照，檢測嬰幼兒配方乳粉中GOS含量。通過對儀器色譜條件及前處理方法進行比較優化，發現該方法線性關系良好，R2為0.999 7，RSD為3.5%，加標回收率為87.7%～92.4%。張志國等[50]建立指紋圖譜法測定嬰幼兒配方乳粉中GOS含量的方法，利用IC構建GOS指紋圖譜，分析得到特征組分，進而測定嬰幼兒配方乳粉中GOS含量，結果表明，當稱樣量為1.0 g時，GOS檢出限為2.5 g/kg，定量限為5.0 g/kg，線性范圍為4.0～64.5 g/kg，回收率為94.0%～106.7%，RSD為1.2%～2.8%，表明指紋圖譜法的準確度和精密度滿足嬰幼兒配方乳粉中GOS含量測定的需要。

朱偉等[51]建立了一種同時測定嬰幼兒配方乳粉中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖的高效離子色譜檢測技術，采用CarboPac PA20色譜柱（3.0 mm×150 mm，6.5 μm）分離，以氫氧化鈉-乙酸鈉為流動相，進行梯度洗脫，使用脈沖安培檢測器進行檢測。結果表明，8 種功能性低聚糖得到很好分離，回收率為80.0%～103.0%，RSD＜3%（n=6）。該方法能快速、準確、可靠地檢測嬰幼兒配方乳粉中功能性低聚糖的含量。

Cataldi等[46]建立一種簡單、靈敏的用于分離和定量乳粉中單糖和二糖的液相色譜方法，經凈化和適當稀釋后測定樣品中乳糖、半乳糖、葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖含量，分離過程在高效陰離子交換色譜儀（配備脈沖電流檢測器）中完成，以金作為電極，乙酸鋇的堿溶液（含10 mmol/L氫氧化鈉和1 mmol/L乙酸鋇）作為流動相，根據樣品的不同，考慮最佳分離效果選取洗脫液，確保沒有基質效應影響。結果表明，該方法具有良好的靈敏度和準確度，可以用于牛乳、干酪等乳制品中單糖和二糖的檢測。

4 LC-MS法

除了GC、GC-MS、HPLC和IC外，液相色譜-質譜法也被用來分析乳粉中糖類。劉蕓等[17]建立高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜測定乳粉中低聚果糖的方法，采用碳水化合物分析柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）進行分離，以乙腈與0.1%乙酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，質譜采用正離子模式，結果表明，該方法對蔗果三糖和蔗果四糖的檢出限可達100 μg/kg，對蔗果五糖的檢出限可達55 μg/kg，加標回收實驗結果表明，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的平均回收率為75.8%～107.3%，RSD為1.6%～8.3%。甄振鵬等[18]建立乳粉中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖的HPLC-MS/MS檢測方法，采用XBridgeTMAmide柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），以乙腈-氨水溶液為流動相進行洗脫，選擇電噴霧質譜負離子源，在多反應監測模式下進行測定，結果表明，該方法對蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖的檢出限分別為0.032、0.022、0.039、0.054 mg/kg，回收率為90.8%～95.8%，RSD為3.6%～9.0%（n=6）。甄振鵬等[19]還建立了測定乳粉中棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖的HPLC-MS/MS方法，同樣采用XBridgeTMAmide柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），以乙腈-水溶液為流動相進行洗脫，選擇電噴霧離子源負離子模式，在多反應監測模式下進行測定，結果表明，該方法對棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖的檢出限分別為13.4、7.7、11.1 μg/kg，回收率為80.8%～86.6%，RSD為3.0%～8.0%（n=6）。

5 結 語

對于沒有紫外吸收的低聚糖類，通常采用HPLC-示差折光檢測器法、HPLC-蒸發光散射檢測器法和IC法測定。示差折光檢測器法存在系統平衡時間長、分析過程需要恒溫且無法梯度洗脫的問題，另外，該方法檢測靈敏度低，對于低聚果糖含量0.5%～2.0%的添加益生元的食品非常不適用。HPLC-蒸發光散射檢測器法和IC法克服了示差折光檢測器方法的不足，雖然靈敏度有所提高，但對于含有單糖和雙糖的乳粉中低聚果糖的測定效果很差，從而影響了低聚果糖的準確定量。為了能夠良好分離簡單基質樣品中的低聚果糖，需要花費分析時間。IC法和蒸發光散射檢測器法在分析復雜基質樣品時存在前處理過程復雜和定量結果偏差大等不足。對于以上問題，考慮到乳粉樣品基質較復雜，充分利用高分辨質譜在靈敏度和抗干擾能力方面的優勢，建立前處理過程簡便、分析時間短、測定結果準確的方法成為未來乳粉中糖類檢測的重要發展趨勢。