基于線粒體DNA控制區序列的團頭魴3個選育群體遺傳變異分析

唐首杰 畢詳 張飛明 張友良

摘要：為從遺傳多樣性的角度來了解團頭魴3個選育群體的選育潛力，以團頭魴浦江1號選育奠基群體（F0）為對照組，采用線粒體DNA控制區標記評估團頭魴3個選育群體的遺傳多樣性，分析它們的選育潛力。結果顯示，在3個選育群體的72條序列中共確定40種單倍型，群體間存在5種共享單倍型，3個選育群體線粒體DNA控制區序列的單倍型多樣性（H）范圍為0.670～0.978，核苷酸多樣性（π）范圍為0.004 16～0.006 23，平均核苷酸差異數（K）范圍為3.935～5.960，群體內核苷酸序列間平均遺傳距離范圍為0.003 561～0.004 538，3個選育群體的遺傳多樣性水平（H、π、K）略高于F0群體。3個選育群體間Kimura雙參數遺傳距離和遺傳分化指數（FST）范圍分別為0.004 039～0.004 700 和0.046 4～0.138 6。3個選育群體間成對FST值差異均顯著（P<0.05），3個選育群體與F0群體間成對FST值差異均極顯著（P<0.01）。說明3個選育群體的遺傳多樣性較高，選育潛力較大;同時，選育群體間均存在顯著的遺傳分化，可見不同方向上的累代人工選育已在一定程度上改變了選育群體的遺傳結構。

關鍵詞：團頭魴;選育群體;遺傳變異;線粒體DNA;遺傳多樣性

中圖分類號： S931.1?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0191-05

在魚類育種過程中，維持魚類選育群體遺傳多樣性，一方面可提高選育群體對環境的適應能力和對疾病的抵抗力[1]，另一方面足夠的遺傳變異水平對保持長期選育過程中的選擇反應具有重要作用[2]。在實際的魚類選育工作中，育種工作者通常采用科學合理的方案對魚類的重要經濟性狀進行有計劃、有目的的選擇，如保持足夠大的親本群體、創造適宜的養殖環境等。然而，選育條件下魚類的繁殖多是在人工控制條件下進行的，在進行人工繁殖的過程中，親本對的選擇不可能是完全隨機的，因此，封閉的選育群體仍可能受到非隨機交配、遺傳漂變等因素的影響，從而導致遺傳多樣性的下降和稀有等位基因的喪失，并進一步增加近交衰退的風險[3]。近年來許多研究顯示，累代人工選育致使魚類選育群體遺傳多樣性逐代降低[4-5]。Gallardo等的研究表明，銀大馬哈魚（Oncorhynchus kisutch）經連續4代人工選育后，選育群體近交率高達9.5%，平均每代近交率約為2.45%，近交導致選育群體繁殖力顯著下降[6]。因此，在長期的魚類選育過程中，及時監測選育群體內遺傳變異水平，保持選育群體的遺傳多樣性，是長期選育工作獲得最終成功的保證[7-8]。

團頭魴浦江1號是經16年6代高強度系統選育而成的首例草食性魚類選育良種[9]。自浦江1號審定以來，上海海洋大學水產種質資源研究室堅持繼續選育，至今已達第10代（F10）。鑒于沒有永遠的良種這一理念和推陳出新的時代要求，筆者所在研究室在浦江1號良種（F10）的基礎上，基于配套系育種理念[10]，以不同選育目標分別建立3個團頭魴配套選育系，并對這3個配套育種群體進行連續多代的選育純化，而連續世代的選育對選育群體遺傳多樣性影響程度、3個選育群體是否存在繼續選育的潛力，至今尚未有精確的遺傳檢測手段來進行定量評估。

魚類線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）具有分子小、結構簡單、進化速度快、遵從母系遺傳等特點[11]，而mtDNA控制區是整個mtDNA序列和長度變異最大的區域，已被成功應用于褐鱒（Salmo trutta）[12]、鯉（Cyprinus carpio L.）[13]、紅大馬哈魚（Oncorhynchus nerka）[14]等養殖魚類種群遺傳多樣性的檢測和評估。

本研究以團頭魴浦江1號選育奠基群體（F0）為對照組，通過mtDNA控制區序列變異來評估團頭魴3個選育群體的遺傳多樣性和遺傳結構，分析它們的選育潛力，為選育群體遺傳性能的保護提供依據，并為下一步配套系選育工作提供理論指導。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

對照組為團頭魴浦江1號選育奠基群體（F0），系1985年淤泥湖團頭魴原種在上海海洋大學魚類種質研究試驗站自繁的后代;試驗組為3個團頭魴選育群體，其來源和性質如下：（1）選育群體A（以下簡稱A），團頭魴浦江1號選育系F10;（2）選育群體B（以下簡稱B），以人工誘導異源四倍體群體（團頭魴浦江1號♀×三角魴[XZ（20#]♂[XZ）]）[15]為奠基群體，經群體選育的第3代（F3）;（3）選育群體C（以下簡稱C），以團頭魴連續2代人工誘導減數分裂雌核發育群體[16]為奠基群體，經群體選育的第3代（F3）。對照組群體采自上海海洋大學魚類種質研究試驗站，試驗組群體均采自上海市松江區水產良種場。群體A、群體B和群體C的采樣數均為24尾，F0群體采樣12尾，剪取每尾試驗魚的尾鰭，編號后于95%乙醇中保存備用。前期采樣工作于2017年1月完成，后續實驗室分析工作于2017年7—9月在上海海洋大學淡水水產種質資源重點實驗室完成。

1.2?試驗方法

1.2.1?基因組DNA提取

基因組DNA提取采用常規的酚/三氯甲烷法[17]進行。

1.2.2?線粒體DNA控制區引物設計

團頭魴線粒體DNA控制區（D-loop區）位于轉脯氨酸（tRNA-Pro）基因和轉苯丙氨酸（tRNA-Phe）基因之間，根據GenBank中已報道的團頭魴線粒體DNA全序列（登錄號為NC_010341.1），利用在線引物設計軟件Primer3[18]設計D-loop區的正向引物和反向引物。引物序列及退火溫度見表1。所有引物均由生工生物工程（上海）技術服務有限公司合成。

1.2.3?PCR擴增及檢測

PCR擴增反應在Eppendorf Mastercycler gradient PCR儀上進行，樣品的反應總體積為 50 μL，包括正向引物2.5 μL（5 μmol/L）、反向引物2.5 μL（5 μmol/L）、2×PCR Reagent 25 μL、DNA模板1 μL、無菌水19 μL;PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，56.4 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，35個循環;72 ℃延伸10 min。

取2 μL擴增產物經1.5%進口分子生物學級瓊脂糖凝膠（含0.5 g/mL EB）電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，電壓為 5 V/cm，經1.5 h后，用Gene Genius凝膠成像系統拍照、記錄和分析。

1.2.4?DNA序列測定

所有樣品委托生工生物工程（上海）技術服務有限公司進行純化和單向測序，測序引物為控制區的正向引物（F），序列測定儀為美國ABI公司PRISM 3730型全自動序列分析儀。

1.3?數據處理和分析

用BLAST軟件[19]搜索GenBank中團頭魴（Megalobrama amblycephala ，序列登錄號為NC_010341.1）的線粒體DNA控制區序列，與本試驗測得的團頭魴相應序列結果進行同源性比較;然后用BioEdit軟件[20]對測序結果進行編輯，用Clustal W軟件[21]進行序列重排和同源比較，并進行人工核對校正。用DNAsp 4.10軟件[22]計算多態位點數、單倍型多樣性（haplotype diversity，H）[23]、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，π）[24]和平均核苷酸差異數（average number of nucleotide differences，K），序列變異中性檢驗（neutrality test）用Tajima的D統計檢驗[25]。單倍型多樣性（H）和核苷酸多樣性（π）計算公式如下：

式中：n為群體樣本大小;pi為第i個單倍型在群體中出現的頻率;k為單倍型數目;xij為第i個核苷酸（A、G、C或T）在序列中的第j位點上的頻率;L為序列的長度。

用Arlequin 3.01軟件[26]估測群體間成對FST值[27]，并利用置換檢驗法進行顯著性檢驗（重復次數為1 000）。

采用分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）估算各群體間和群體內的遺傳變異及分化水平。通過3種分子遺傳變量進行分析：FST為群體內個體之間的遺傳變異;FSC為組內各群體間的變異程度;FCT為不同組別之間的遺傳變異程度。并用置換檢驗法進行1 000次重復模擬計算，以上運算在Arlequin 3.01軟件[26]中完成。

用MEGA 4.0軟件包[28]根據Kimura Two-Parameter法[29]計算群體內和群體間核苷酸序列的兩兩間遺傳距離，用非加權配對算術平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）和鄰接法（neighbour-joining method，NJ）構建群體間的分子系統樹（kimura two-parameter法估算遺傳距離）。

2?結果與分析

2.1?PCR擴增產物序列測定及排序結果

4個團頭魴群體共84個個體的線粒體DNA控制區片段的PCR擴增產物經純化后測序，各擴增片段經同源重排后的長度（不包括插入/缺失）為962 bp。

2.2?4個團頭魴群體的遺傳結構

2.2.1?群體內遺傳多樣性分析

4個團頭魴群體內的單倍型分布及頻率見表2。在所分析的84條序列中，確定了46種單倍型，F0群體與其他3個選育群體間無共享單倍型，3個選育群體間存在5種共享單倍型，其中單倍型H1為A群體、B群體和C群體所共享，單倍型H10為A群體和C群體所共享，單倍型H13、H17和H18為B群體和C群體所共享。F0群體中出現頻率最高的單倍型為H41，H1分別為A群體、B群體和C群體中出現頻率最高的單倍型。

4個團頭魴群體內的遺傳多樣性參數見表3。各群體內單倍型數范圍為6～19，其中C群體的單倍型數最多，F0群體的單倍型數最少。4個團頭魴群體內線粒體DNA控制區的單倍型多樣性（H）在0.670～0.978之間，其中C群體的單倍型多樣性最高，A群體的單倍型多樣性最低，單倍型多樣性在4個群體中的變化趨勢由高到低依次為C群體>B群體>F0群體>A群體。

4個團頭魴群體內線粒體DNA控制區核苷酸多態位點數在11～22之間，核苷酸多樣性（π）在0.00267～0.00623之間，平均核苷酸差異數（K）的范圍為2.485～5.960;群體內個體間平均核苷酸差異數和核苷酸多樣性在4個群體中的變化趨勢一致，即C群體>B群體>A群體>F0群體。A群體的多態位點數最多（22個），F0群體的多態位點數最少（11個）。3個團頭魴選育群體Tajima's D中性檢驗均不顯著，符合中性突變。

總體而言，C群體遺傳多樣性水平最高，F0群體遺傳多樣性水平最低，3個團頭魴選育群體遺傳多樣性水平高于F0群體。

2.2.2?群體間遺傳距離和遺傳分化

如表4所示，4個團頭魴群體內線粒體DNA控制區核苷酸序列間的平均遺傳距離在0.002 526～0.004 538之間，在4個群體間的變化趨勢為C群體>B群體>A群體>F0群體，這與上文中的核苷酸多樣性（π）、平均核苷酸差異數（K）的分析結果一致。

4個團頭魴群體間的平均遺傳距離在0.004 039～0.006 140 之間，F0群體與C群體間的遺傳距離最大，為 0.006 140，A群體與B群體間的遺傳距離最小，為 0.004 039。對于3個選育群體而言，A群體與C群體間遺傳距離最大，為0.004 700。

如表5所示，群體間的遺傳分化指數（FST）在0.046 4～0.396 7之間，F0群體與C群體之間的遺傳分化指數最高，為0.396 7，B群體與C群體之間的遺傳分化指數最低，為 0.046 4。從群體間顯著分化的P值（0.000 0～0.036 0）可以推斷，群體間成對FST值差異均顯著（P<0.05），表明所有群體間均存在顯著的遺傳分化。

2.2.3?分子方差分析（AMOVA）

本研究對4個團頭魴群體進行分組（1個組、2個組、3個組），從不同角度對群體遺傳變異進行分子方差分析（AMOVA）。結果（表6）顯示，在任何一種分組條件下，FST值都達到了極顯著水平（P<0.01），說明群體內個體間的遺傳分化極顯著。當把所有群體分成2個組或3個組時，FSC值均達到顯著（P<0.05）或極顯著水平（P<0.01），表明群體間存在顯著或極顯著的遺傳分化，這證實了群體間遺傳分化指數（FST值）的分析結果。將4個群體分成2個組時，4個群體在2種分組模式下（模式1：F0群體為一組，其余群體為另一組;模式2：F0群體和A群體為一組，B群體和C群體為另一組），FCT值達到了極顯著水平（P<0.01），表明組別之間存在極顯著的遺傳分化。將4個群體分成3個組時，僅在1種分組模式下（F0群體為第1組，A群體為第2組，B群體和C群體為第3組），FCT值達到顯著水平（P<0.05）。此外，在其他分組模式下，FCT值均未達到顯著水平。

2.2.4?聚類分析

如圖1所示，因聚類方法的差異，2種聚類圖顯示了各自的特點，很難說哪種聚類圖最能反映真實的群體間遺傳關系，但2種聚類圖均顯示，B群體和C群體可被聚為一類，F0群體和B群體間聚類關系較遠，這也驗證了上文中分子方差分析的結果。

3?討論與結論

3.1?團頭魴3個選育群體的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是魚類育種群體具有選育潛力的物質基礎，只有保持選育群體的遺傳多樣性，才能獲得持續的遺傳進展，從而保證魚類選育工作的可持續開展。線粒體DNA標記是評價魚類群體遺傳多樣性水平的有效工具之一[30]，以線粒體DNA序列變異為基礎估算的單倍型多樣性、核苷酸多樣性等參數是衡量群體遺傳多樣性的重要參數。單倍型多樣性是指從樣本中隨機抽取到2個不同單倍型的頻率[23]，單倍型多樣性越高，說明群體內遺傳多樣性水平越高。Nei等將核苷酸多樣性定義為給定群體中隨機選取的DNA序列間平均每個位點的核苷酸差異數目，其值越大，表明群體內的遺傳多樣性越高[24]。

在本研究中，3個選育群體的單倍型多樣性為0.670～0.978（平均值為0.869 3），核苷酸多樣性為0.004 16～0.006 23（平均值為0.005 06），均略高于F0群體，說明長期的選育并未顯著影響選育群體的遺傳多樣性。這與其他魚類選育群體遺傳多樣性研究結果不同[4-5]，已有的研究結果顯示，連續多代選育群體的遺傳多樣性水平低于選育奠基群體[4]或野生對照群體[5]。而在本研究中，F0群體在累代的自繁過程中，可能因隨機遺傳漂變的作用而造成群體內近交程度不斷增加，最終導致群體遺傳多樣性下降。進一步將本研究中的3個選育群體遺傳多樣性結果與國內外其他魚類選育群體的線粒體DNA遺傳多樣性研究結果比較后可以發現，本研究中3個選育群體的遺傳多樣性參數（單倍型多樣性、核苷酸多樣性）均高于草魚（Ctenopharyngodon idella）[5]、松浦鯉（C. carpio ‘Songpu Carp）[31]、奧利亞羅非魚（Oreochromis aureus）[32]、褐鱒（Salmo trutta）[12]、鯉（C. carpio L.）[13]、紅大馬哈魚（Oncorhynchus nerka）[14]等魚類的選育群體的相應參數。綜上所述，本研究中的3個團頭魴選育群體歷經多代選育后仍保持著較高水平的遺傳多樣性，對其進行進一步的選育純化和種質資源聚合利用的潛力較大。

3.2?團頭魴3個選育群體間的遺傳分化

遺傳分化在本質上是基因頻率的概率變化及其雜合性變化的度量[33]，而人工定向選育通過改變群體的基因頻率來促使遺傳分化的產生。遺傳分化指數（FST）常用于度量群體間遺傳分化的相對大小，其數值越大，表明2個群體間的遺傳分化水平越高。本研究中，3個選育群體間遺傳分化指數（FST）為0.046 4～0.138 6，顯著性檢驗結果均顯示（P<0.05），群體間遺傳分化已達顯著水平，此外，選育奠基群體F0與3個選育群體間的遺傳分化指數（FST）為0.257 2～0.396 7，顯著性檢驗結果也顯示，3個選育群體與F0群體間遺傳分化已達極顯著水平（P<0.01）。以上結果表明，不同方向上的累代人工選育在一定程度上改變了選育群體的遺傳結構，使之產生了不同方向的變化，而這種現象正是育種工作者希望看到的結果，因為通過連續多代的選育純化，可以使選育群體遺傳結構逐步趨向穩定，為配套系育種提供優異親本。

3.3?選育群體間種質資源聚合利用探討

雜種優勢利用是魚類配套系育種的重要課題之一，也是魚類優異種質資源聚合利用的基礎，準確預測雜種優勢對加快配套系選育進程具有重要意義。一般而言，雜種優勢大小與相互雜交的2個親本群體間的遺傳差異直接相關。親本群體之間的遺傳差異越大，雜交后代就越可能獲得雜種優勢。親本群體之間的遺傳距離是衡量親本間遺傳差異的一個重要指標，遺傳距離越大，雜交后代的雜種優勢就越強[34]。在本研究中，對于3個選育群體而言，群體間Kimura雙參數遺傳距離顯示，A群體與C群體間遺傳距離最大，為0.004 700，A群體和B群體間的遺傳距離最小，為0.004 039。由此可以預測，A群體與C群體進行群體間雜交可能獲得較明顯的雜種優勢，然而A群體和B群體間雜交后代的雜種優勢可能較小。以上結果為團頭魴選育群體優異種質資源的聚合利用提供了參考。

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