不同Ca2+源、Mg2+源對固態發酵產納豆激酶的影響

孟 健，陸麗霞，熊曉輝

(南京工業大學 食品與輕工學院，江蘇 南京 211800)

傳統溶栓藥物如尿激酶、鏈激酶等具有人體內半衰期短、口服無效、易出血等缺點。1987年，日本科學家Sumi等[1]從納豆食品中分離到具有強烈纖溶活性的物質，并命名為納豆激酶(nattokinase，NK)，NK有望彌補傳統溶栓藥物的不足，具有較大的開發潛能，成為新一代抗栓藥物[2-4]，也可開發為優良的保健食品。由于微生物種類多，繁殖快，容易培養，生長條件易于控制，提取工藝也較簡單，且隨著老年人口增加及運動、飲食的影響，發生血管栓塞人數不斷增加，因此，近年來微生物源溶栓藥物的研發受到廣泛重視[5-6]。微生物溶栓藥物的研發，旨在提高藥物的醫用價值，關鍵在于提高溶栓藥物中發揮主要作用的酶活性。研究表明，適當離子濃度對固態發酵納豆激酶活力有促進作用，如金屬離子Ca2+、Mg2+對納豆激酶的纖溶活性的提高有不同程度的作用[7]。如劉誠[8]通過研究發現，Mg2+對酶活的提高有作用；李妍[9]經過研究發現，Ca2+、Mg2+、Na+和K+會對酶活的提高有作用。已有的報道主要是研究不同離子對酶活性的影響，本文中，筆者在已有研究的基礎上，研究3種不同Ca2+、Mg2+源對固態發酵產納豆激酶的影響，以確定最佳的Ca2+、Mg2+源和最佳添加量水平，獲得高酶活的納豆產品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，保存于筆者所在實驗室。

蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、營養瓊脂，北京奧博星生物技術有限責任公司；NaCl(分析純，下同)、可溶性淀粉、CaCl2(食品級)、 NaH2PO4、Na2HPO4、K2HPO4、KH2PO4，西隴化工股份有限公司；酵母浸膏、HCl(分析純)、NaOH(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；乳酸鈣(CaC6H10O6·5H2O食品級)、CaCO3(食品級)，廣東汕頭市西隴化工廠；MgSO4(食品級)、MgCl2(食品級)、MgCO3(食品級)，連云港科德化工有限公司；牛纖維蛋白(74 mg/支)、凝血酶(160 BP/瓶)、尿激酶(1 240 IU/瓶)，中國藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與設備

全溫搖瓶柜，太倉市強樂實驗設備有限公司；真空冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；恒溫恒濕培養箱，廣東省醫療器械廠；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；電熱鼓風干燥箱、立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司設備廠；XJA-100A型高速粉碎機，上海標本模型廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶活標準曲線的制作

納豆激酶(NK)活力的測定是以其相對于尿激酶的活力單位來表示的，故需要建立尿激酶的活力單位與纖維蛋白平板溶圈大小間的相關性[10]。

以不同活力單位的尿激酶溶液為標準，制作標準曲線。將尿激酶標準品用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液依次稀釋至6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0 IU/mL，分別用微量進樣器各取10 μL尿激酶溶液點樣于制作好的纖維蛋白平板上。放入37 ℃恒溫培養箱中反應18 h，然后分別測定纖維蛋白溶解圈的2個垂直直徑，計算其乘積近似為纖維蛋白溶解圈的面積，并根據尿激酶的活力單位與纖維蛋白溶解圈的面積繪制酶活標準曲線。

1.3.2 納豆的制備

洗凈后的豆子與水按1∶ 1的體積比浸泡適當時間后，加入2%可溶性淀粉，0.5%酵母膏，攪拌至充分溶解后，調節pH(7.2～7.4)。在121 ℃下滅菌40 min，滅菌結束后取出，冷卻至室溫后，接種5%種子培養液，攪拌均勻后，37 ℃下發酵培養24 h，發酵結束后在冷凍干燥機上預凍結，凍結完成后干燥36 h即可[11-12]。

1.3.3 納豆激酶活力測定

按1.3.2節的方法制備納豆，發酵結束后的納豆經打磨成糊粉狀，稱取2 g糊粉狀納豆溶于18 mL生理鹽水中，適當稀釋即為粗酶樣液。微量進樣器取待測NK樣液10 μL，點樣于纖維蛋白平板上，同時將一定單位的標準尿激酶溶液點樣于纖維蛋白平板上作為對照，放入37 ℃恒溫培養箱中反應18 h，然后分別測定纖維蛋白溶解圈的2個垂直直徑，計算其乘積近似為纖維蛋白溶解圈的面積。

溶解圈面積直接反映了酶活力的相對大小，將NK溶解圈面積與標準的尿激酶UK的溶解圈面積相比較，得出NK相當于尿激酶活性單位(IU/mL)。NK活性計算見式(1)，納豆粉的酶活性計算見式(2)。

(1)

(2)

式中：m表示稱取糊粉狀納豆的質量(g)，V表示納豆粉與生理鹽水溶液的總體積(mL)。

1.3.4 活菌數測定方法

取4 g發酵結束后的納豆置于裝有36 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩混勻后，制成1∶ 10的樣品液，移液槍吸取1 mL樣液依次做10倍系列稀釋，選用適宜的稀釋倍數，吸取1 mL稀釋液于無菌平板上，平板倒入適量的培養基液，迅速混勻，做3個平行培養皿。待凝固后倒置，37 ℃恒溫培養24 h。選用菌落數在30～300的培養皿，進行菌落計數[13]。

1.3.5 不同Ca2+及添加量對固態發酵產納豆激酶的影響

以CaCl2、CaCO3、CaC6H10O6·5H2O為Ca2+源，配制不同添加量水平的豆子樣液，于250 mL的三角瓶中進行搖床發酵，同時做平行，考察不同Ca2+源及添加量對固態發酵產納豆激酶的影響[14]。培養基其他成分、培養條件同1.3.2節納豆的制備。以不添加離子源的實驗組為空白組。Ca2+的添加量水平按混合后豆子與水質量總和的質量百分比計算。

1.3.6 不同Mg2+及添加量對固態發酵產納豆激酶的影響

以MgCl2、MgCO3、MgSO4分別為Mg2+源，具體方法、培養條件參照方法1.3.5節。

1.3.7 納豆的感官評價

感官評價人員12人，得分是去掉1個最高分和1個最低分取平均分。不同Ca2+源、Mg2+源制成的納豆通過產品的顏色、香氣、滋味、組織形態4個指標來進行感官評定，每個指標滿分為10分。感官評價標準[15]見表1。

表1 納豆產品的感官評定標準

2 結果與討論

2.1 酶活標準曲線

尿激酶酶活標準曲線如圖1所示。

圖1 尿激酶標準曲線Fig.1 Standard curve for urokinase

從圖1中可以看出，尿激酶的酶活與其溶解圈的面積成線性關系，其方程為：y=0.004 3x+0.136 9(x表示納豆激酶相對酶活性，y表示平板溶解圈的面積)，相關系數R2=0.993 4。根據此線性方程，可以計算出納豆中納豆激酶的相對尿激酶活性。

2.2 不同Ca2+及添加量對固態發酵產納豆激酶的影響結果

不同Ca2+及其不同添加量對固態發酵產納豆激酶的影響如圖2～4所示。

圖2 不同CaCO3添加量對固態發酵產 納豆激酶及菌體量的影響Fig.2 Effects of different additions of CaCO3 on the growth of nattokinase and amount of bacteriaby solid-state fermentation

由圖2可以看出：隨著CaCO3添加量的增加，納豆激酶活力和菌體量呈現出先上升后下降的趨勢。當CaCO3添加量0.4%時，此時納豆激酶活性達到9 100 IU/g，同時菌體量達到6.3×107CFU/g；之后，隨著CaCO3添加量的增加，納豆激酶活性、菌體量呈現下降的趨勢，表明以CaCO3作為Ca2+源，最佳添加量為0.4%，在該添加量下，納豆激酶活性較空白組的酶活性(6 260 IU/g)相比提高了45%。

圖3 不同CaCl2添加量對固態發酵產 納豆激酶及菌體量的影響Fig.3 Effects of different additions of CaCl2 on the growth of nattokinase and amount of bacteria by solid-state fermentation

由圖3可以看出：CaCl2作為Ca2+源，CaCl2添加量對納豆激酶活性、菌體量有一定的影響。CaCl2添加量水平低于0.04%，利于酶的分泌合成、菌體的生長、繁殖；當CaCl2添加量繼續增加，納豆激酶活性、菌體量逐漸下降。表明CaCl2作為Ca2+源，最佳的添加量為0.04%，此時的納豆激酶活性達到7 786 IU/g，比空白組的酶活力4 960 IU/g提高了57%，菌體量達到5.4×107CFU/g。

圖4 不同乳酸鈣添加量對固態發酵產 納豆激酶及菌體量的影響Fig.4 Effects of different additions of calcium lactate on the growth of nattokinase and amount of bacteria by solid-state fermentation

由圖4可以看出：乳酸鈣作為Ca2+來源，隨著添加量的增加，納豆激酶活性和菌體量呈現出先上升后下降的趨勢。當添加量為0.3%時，納豆激酶活性8 453 IU/g，比空白組的酶活性6 260 IU/g提高了35%，菌體量達到8.6×107CFU/g，此時的酶活性最高、菌體量最多，利于發酵過程中酶活的分泌合成，菌體的生長繁殖。

3種最佳添加量水平的Ca2+源制備的納豆，在酶活提高效果方面，CaCO3、CaCl2制備的納豆激酶活性提高率高于乳酸鈣制備的納豆，表明在發酵過程中，CaCO3、CaCl2作為Ca2+源更能促進納豆激酶的分泌合成；從菌體量方面來看，菌體量總數差異不大。選用0.04% CaCl2為Ca2+源為宜，酶活提高效果最高。

2.3 不同Mg2+及添加量對固態發酵產納豆激酶的影響結果

不同Mg2+及不同添加量對固態發酵產納豆激酶的影響如圖5～7所示。

圖5 不同MgCl2添加量對固態發酵產 納豆激酶及菌體量的影響Fig.5 Effects of different content of MgCl2 on the growth of nattokinase and amount of bacteria by solid-state fermentation

由圖5可以看出：以MgCl2作為Mg2+源，隨著MgCl2添加量的增加，納豆激酶活性總體上有所提高，菌體量逐漸增加。當添加量為0.06%時，納豆激酶活性相對較高，達到6 040 IU/g，比空白組的酶活性4 981 IU/g提高了21%，菌體量達到9.6×107CFU/g；MgCl2添加量超過0.08%之后，納豆激酶活性較空白組相比有所下降，菌體量降低，同時MgCl2添加量低于0.04%，對納豆激酶活性、菌體量提高效果不明顯。說明以MgCl2作為Mg2+源，MgCl2適宜的添加量范圍為0.04%～0.08%?？紤]到菌體量、生產成本因素，選用0.06% MgCl2為Mg2+源。

圖6中，以MgCO3作為Mg2+源，隨著MgCO3添加量的增加，納豆激酶活性呈現出先上升后下降的趨勢。MgCO3添加量達到0.16%時，納豆激酶活性最高可達8 704 IU/g，比空白組的酶活性6 188 IU/g提高了40%，菌體量達到4.8×107CFU/g。不過，隨著添加量的增加，菌體量逐漸降低，說明以MgCO3作為Mg2+源發酵制備納豆，對菌體的生長繁殖有一定的抑制作用。

圖6 不同MgCO3添加量對固態發酵產 納豆激酶及菌體量的影響Fig.6 Effects of different content of MgCO3 on the growth of nattokinase and amount of bacteria by solid-state fermentation

從圖7中可以看出：以MgSO4作為Mg2+源，隨著添加量的增加，納豆激酶活性和納豆菌呈現出先上升后下降的趨勢，MgSO4添加量達到0.72%時，此時納豆激酶活性達到10 591 IU/g，比空白組的酶活性6 188 IU/g提高了71%，菌體量達到7.8×107CFU/g，效果最佳。之后，隨著添加量的繼續增加，納豆激酶活性、菌體量呈現下降的趨勢，表明當以MgSO4作為Mg2+源，MgSO4最佳添加量是0.72%。

圖7 不同MgSO4添加量對固態發酵產 納豆激酶及菌體量的影響Fig.7 Effects of different content of MgSO4 on the growth of nattokinase and amount of bacteria by solid-state fermentation

3種最佳添加量水平的Mg2+源制備的納豆，在酶活提高效果方面，MgSO4、MgCO3制備的納豆激酶活明顯高于MgCl2制備的納豆，不過MgCO3作為Mg2+源發酵制備納豆，對菌體的生長繁殖有一定的抑制作用。選擇0.72% MgSO4為Mg2+源為宜，納豆激酶酶活提高效果最好。

2.4 納豆的感官評價結果

不同離子源制備的納豆產品通過產品的顏色、香氣、滋味、組織形態4個指標來進行感官評定，每個指標滿分為10分，結果如表2。

表2 不同離子源制備的納豆感官評價

不同離子源制備的納豆產品在感官上有所差異。由表2可以看出：以不同離子源制備的納豆制備感官評分總分與空白組相比相差不大。不過在單項評分上有明顯的差異。在香氣方面，以CaC6H10O6·5H2O為Ca2+源制備的納豆，有納豆特有的香氣，而CaCO3、CaCl2、空白組制備的納豆略帶有氨味；在組織形態方面，CaCl2、CaC6H10O6·5H2O制備的納豆有很多的黏細絲，而CaCO3、空白組制備的納豆的黏細絲相對較少；在納豆顏色和滋味方面，3種Ca2+制備的納豆與空白組之間相差不大。不同Mg2+源制備的納豆在納豆顏色方面，都呈黃色、微紅，彼此相差不大，和空白組制備的納豆顏色基本相符；在香氣方面，MgCO3制備的納豆略帶氨味，明顯不如MgCl2、MgSO4、空白組制備的納豆有特有的香氣；在滋味方面，MgCl2制備的納豆不如MgCO3、MgSO4、空白組制備的納豆酥軟、濕滑，口感不佳；在組織形態方面，MgSO4制備的納豆相比于其他2種Mg2+源、空白組制備的納豆，有較多細長的黏絲。綜合考慮上述研究的納豆激酶活提高效果、菌體量、納豆的感官評價結果、生產成本等因素，選用0.04% CaCl2為Ca2+源，0.72% MgSO4為Mg2+源發酵制備納豆。

3 結論

綜合考慮納豆功能性成分、納豆感官評價結果、節約成本等方面，得出CaCl2為最佳Ca2+源，最佳添加量0.04%，制備的納豆激酶活性達到7 786 IU/g，相比空白組酶活性提高了57%，菌體量為5.4×107CFU/g；MgSO4為最佳Mg2+源，最佳添加量0.72%，制備的納豆激酶活性達到10 591 IU/g，相比空白組酶活性提高了71%，菌體量達到7.8×107CFU/g。感官評價結果顯示，以不同離子源制備的納豆制備感官評分總分與空白組相比無顯著差異，單項指標上有差異。CaCl2制備的納豆雖略帶有氨味，但有很多的黏細絲；MgSO4制備的納豆酥軟、濕滑，口感較佳，且有很多的黏細絲。