基于16S rDNA測序對茶園土壤細菌群落多樣性的研究

楊廣容,馬 燕,蔣 賓,馬會杰,謝 瑾,呂才有,李永梅

1 云南農業大學龍潤普洱茶學院,昆明 650201 2 云南農業大學資源與環境學院,昆明 650201

茶樹[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]是我國南方重要多年生木本經濟作物,2016年,中國茶葉種植面積達293.3×104hm2,約占全球植茶面積的60%以上[1]。茶園土壤環境質量是影響茶葉產量和品質的重要因素之一[2]。茶樹在長期連作栽培中不斷適應熱帶和亞熱帶氣候及土壤環境條件,逐漸進化形成了其特有的土壤生態環境特征,如喜溫怕冷、喜酸怕堿、喜濕怕澇、喜銨厭硝、聚鋁嫌鈣、忌氯富錳等。茶樹作為典型的喜酸作物,能在pH3.2—6.8的土壤中生長[3-4]。茶園土壤由于茶樹長期單一化種植,作物根系分泌物多樣性低,施肥、修剪和茶樹凋落物歸還等原因,致使茶園土壤隨茶樹種植時間延長而酸化[5-6]。

土壤微生物是土壤中最活躍且多樣性最為豐富的組分之一,其群落的組成結構、活性及多樣性很大程度上決定了土壤中的營養元素循環和土壤的肥力,是反映土壤質量及評價土壤生態系統可持續性的重要生物學指標,對土壤養分、結構、穩定性上具有重要的影響[5-8]。同時,植被類型和多樣性、土壤水分、pH、土壤類型及其理化性狀、土地利用方式、有機質、有效磷和速效鉀均顯著影響微生物群落結構[6,9-11]。如Lauber等認為pH值是決定土壤微生物群落結構的主要因素[12],有研究表明在pH小于6.5的土壤中,土壤微生物多樣性隨著pH的降低隨之降低[13]。已有學者證實,茶園土壤微生物及細菌群落結構受多種生態因子的影響,如：茶樹品種及樹齡、海拔、季節、施肥及修剪等[5,14-17]。

王秀青等[18]對茶園土壤微生物細菌、真菌和放線菌純培養研究表明,茶園土壤微生物數量普遍高于森林土壤,并且現代茶園微生物的總數量高于古茶園。細菌是土壤中數量最多、分布最廣的微生物,它占土壤微生物總數的70%—90%,其干重約占土壤有機質的1%[4]。由于絕大多數土壤微生物難以培養分離,導致傳統研究方法獲得的土壤微生物信息較少,不能真實反映土壤微生物的群落結構及功能。采用現代分子生物學研究手段,從土壤中提取微生物宏基因組總DNA,并通過PCR擴增及測序,準確鑒別土壤細菌群落結構及多樣性[3-4,19-21],能有效克服傳統平板培養計數法的缺陷,也是目前土壤微生物研究的重要內容。本研究以3個古茶園土壤為研究對象,分別以森林和現代茶園土壤為對照,通過直接提取土壤微生物基因組總DNA,采用16S rDNA基因的通用引物PCR擴增及Illumina平臺Miseq高通量測序技術,鑒定和比較森林、現代茶園和古茶園土壤細菌的群落結構多樣性與差異,為深入了解茶園土壤細菌種群結構演變規律、調節茶園土壤環境質量和改善土壤管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 土壤采樣與處理

1.1.1采樣茶園位點概況

選擇云南西雙版納州勐?？h代表性古茶山景邁山(大平掌)、布朗山(賀開村)和南糯山(半坡竹林小組)的現代茶園(J2、B2和N2)、古茶園(J3、B3和N3)及其附近森林(J1、B1和N1)。各茶園均為生態茶園,除景邁山和布朗山的現代茶園每年進行土壤翻耕外,其他茶園均處于免耕狀況,所有茶園栽培管理均為不施肥、不施農藥的有機茶園或生態茶園。采樣茶園的生態環境概況見表1。

1.1.2土樣采集與處理

土樣采集時間為2015年5月中旬,云南春茶采摘末期。根據采樣茶園的地形條件,在20×20 m區域內,采用3—5點混合取樣法,每個采樣點沿著茶樹樹冠邊緣垂直投影取樣,適當清除地表的枯枝落葉,用土鉆采集0—20 cm表層土壤,混合均勻,剔除雜質,形成一個土樣,每一茶園重復取3個土樣。一部分土樣(約20 g)裝入無菌袋及時用液氮冷凍后-86℃保存,供分子生物學研究,另一部分土樣(約500 g)24 h內室內自然風干,過2 mm或0.15 mm篩用于土壤pH值、陽離子交換量(CEC)、有機質(SOM)、全氮(TN)、全磷(TP)、全鉀(TK)、有效氮(堿解氮)、速效磷(Olsen-P)、速效鉀及土壤礦質元素有效性鈣鎂鐵銅鋅錳的測定。

表1 茶園采樣位點基本情況Table 1 The basic situation of soil sampling points of tea gardens

1.2 土壤特性及養分含量測定

1.2.1土壤pH值：采用1∶2.5土水(質量)比,用玻璃復合電極法測定。

1.2.2陽離子交換量(cation exchange capacity,CEC)用乙酸銨交換提取—蒸餾法。

1.2.3土壤有機質(soil organic matter,SOM)用重鉻酸鉀容量法—外加熱法。

1.2.4全氮(total nitrogen,TN)用濃硫酸-雙氧水消煮—凱氏定氮法；全磷(total phosphorous,TP)用硫酸-雙氧水消煮—鉬銻抗比色法；全鉀(total potassium,TK)濃硫酸-雙氧水消煮—火焰光度法。

1.2.5有效氮磷鉀：堿解氮(alkali-hydrolyzable nitrogen)用1 mol/L NaOH堿解擴散法；速效磷即Olsen-P用0.5 mol/L NaHCO3溶液浸提—鉬藍比色法；速效鉀(available potassium)用乙酸銨浸提—火焰光度法。

1.2.6土壤有效性銅(Cu)、鋅(Zn)、錳(Mn)用火焰原子吸收分光光度計法[22]。

各土壤樣品的理化性狀見表2。

表2 古茶園與現代茶園土壤基本化學性質比較(平均值±標準偏差,n=3)Table 2 The soil physical and chemical properties (means ± standard deviation,n=3)

不同大、小寫字母表示同一茶山不同土壤間的差異極顯著(P<0.01)和差異顯著(P<0.05)

1.3 土壤細菌測序

1.3.1土壤DNA提取

土壤DNA提取參照Proteous等[23]和楊建等[24]的方法,采用SDS-GITC-PEG法,并作適當修改。稱取0.5 g土樣于2 mL離心管中,所加試劑均按照比例減少20倍,加入氯仿-異戊醇后離心速度改為15 000 g,10 min。其他操作步驟基本不變。

1.3.216S rDNA基因擴增與測序

16S rDNA基因擴增：用16S rDNA基因通用引物341F、806R(見表3)以50 μL體系進行PCR擴增。PCR條件：用帶有barcode的特異引物擴增樣本16S rDNA特定的V3—V4區域,擴增體系為：50 μL反應體系中包含5 μL的10× KOD Buffer,5 μL的2.5 mmol/L dNTPs,1.5 μL引物(5 μmol/L),1 μL的KOD聚合酶,和100 ng模版DNA。擴增條件為：95℃預變性2 min,隨后98℃變性10 s,62℃退火30 s,68℃延伸30 s,共27個循環,最后68℃延伸10 min。

表3 研究中使用的引物Table 3 PCR primers used in this study

測序：對擴增產物切膠回收,用QuantiFluorTM熒光計進行定量。選擇符合測序要求的樣品16S rDNA送基迪奧生物科技有限公司(廣州)對V3和V4區域進行細菌宏基因組測序,將純化的擴增產物進行等量混合,連接測序接頭,根據Illumina官方說明構建測序文庫,Hiseq2500的PE250模式上機測序[25]。

數據質量控制：去除測序過程中產生的接頭污染序列和一些低復雜度序列(如poly A)及含有N的序列,若reads與接頭序列可以連續比對上15 bp的長度,則認為該reads有接頭污染；若reads中poly序列的長度≥10 bp,則為低復雜度序列的reads。在進行后續分析之前,還需要對下機數據中質量值較低的堿基質量值小于20的堿基序列進行過濾,保證將一條reads上質量值高于20的堿基數占堿基總數的百分比小于80%的reads過濾掉。

通過重疊關系將雙末端測序得到的成對序列組裝成一條序列。拼接的條件是最小匹配長度為 50 bp,重疊區域允許的錯配率為0.02,符合條件的序列即為目標序列。每個樣品測序深度,通過繪制shannon稀釋曲線來評價測序量是否足夠,并間接反映樣品中物種的豐富程度。當曲線趨于平緩或者達到平臺期時也就可以認為測序量趨于飽和,基本覆蓋樣品中所有物種,測序深度增加已經不影響物種多樣性。

1.4 數據分析與處理

1.4.1土壤基本性質的分析處理

用SPSS 21.0軟件對實驗數據進行分析,采用單因素方差分析(oneway-ANOVA)和多重比較(LSD)法進行差異顯著性檢驗和多重比較分析(α=0.05和0.01),圖表中的數據均為mean ± SD。

1.4.216S rDNA基因組多樣性的標準信息分析

16S rDNA細菌宏基因組V3和V4區域測序結果通過PE reads過濾,獲得符合條件的序列即為目標序列tag,利用Mothur[25](v.1.34.0)軟件包對tag序列進行了去冗余處理,從中挑選出unique tag序列,并對unique tag的豐度分布進行了統計；使用基于Naive Bayesian方法的分類器rdp classifier工具對tag進行物種注釋[26]。根據序列長度的變化,選擇恰當的Confidence Threshold(為0.5)參數進行物種分類與豐度分析。

1.4.3細菌宏基因組多樣性的高級信息分析

為了更好地獲得樣品中物種的多樣性信息,利用Mothur計算0.03距離下(97%的相似度)的 OTU(Operating Taxonomic Unit)數量及其高級信息OTU豐度、Alpha多樣性及聚類等[27-29]。

結合OTU的物種注釋信息以及OTU在不同樣品中的表達,統計界、門、綱、目、科、屬和種每一個分類水平上各樣品的表達情況,獲得物種分類表達譜,根據物種的分類表達譜的數據,選取豐度較高的部分物種分類單元,用Canoco5.0進行主成分分析(principal component analysis,PCA)。

2 結果與分析

2.1 不同土壤細菌群落豐度及多樣性分析

根據細菌16S rDNA的V3—V4區域測序結果,統計9個土壤樣品細菌群落豐度及多樣性的各項指標(表4)。結果分析表明,所建立細菌文庫的覆蓋率,除景邁山古茶園土壤(coverage=52.73%)外,其余樣本達73.66%—99.55%,平均為83.56%。說明研究所建立的文庫可比較真實有效地反映樣本環境細菌多樣性。森林、現代茶園與古茶園土壤的細菌OTU數目分別為327—17009、5547—25866和10816—27837,表明3座茶山森林土壤的細菌OTU數目差異高達數十倍至數百倍。本研究9個土壤樣本細菌群落的Alpha多樣性統計表明,chao1和ACE指數變化趨勢與OTU指數相一致；景邁山森林(J1)和南糯山森林(N1)與現代茶園(N3)Shannon指數較低,分別為3.17和4.77與4.69,而其他6個土壤的平均Shannon指數達6.98—8.82,說明這6個土壤細菌群落多樣性水平較高。一般高肥力土壤中細菌含量較多,本研究3種古茶園和2個樹齡較長(50年以上,表1)土壤中細菌含量較為豐富(表4),總體上,同一座茶山古茶園土壤細菌的OTU數、Shannon指數、ACE指數、Chao1指數均高于森林和現代茶園土壤,說明古茶園土壤細菌多樣性相對更為豐富。

表4 樣本細菌Alpha多樣性統計Table 4 Statistical analysis of bacterial Alpha deversity in samples

2.2 不同土壤細菌在門水平上的分布

在門分類水平上,經微生物16S rDNA基因測序,檢測到樣品中共有47個菌門,平均豐度達0.11%及以上的菌門共計21個(表5)。從中可知,不同茶山的森林土壤(J1、B1和N1)及同一茶山的森林、現代茶園和古茶園土壤細菌群落分布差異明顯。首先,變形菌門(Proteobacteria)是明顯的優勢細菌類群,其在9個樣品中所占豐度達42.16%—71.85%,平均為50.63%,其次為酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、WPS-2、綠彎菌門(Chloroflexi)、藍藻細菌門(Cyanobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、AD3、疣微菌門(Verrucomicrobia)10個菌門其相對豐度平均達1.06%以上,而其他菌門如芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、泉古菌門(Crenarchaeota)、綠菌門(Chlorobi)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和梭菌門(Fusobacteria)等10個門的相對豐度低于1.00%。其次,21個主要菌門中,布朗山和南糯山森林土壤(B1和N1)細菌覆蓋度達20個菌門,明顯高于景邁山森林土壤(J1,僅10個菌門)。最后,除景邁山外,古茶園土壤細菌群落的門類豐度及均勻度均有增加趨勢。

表5還表明,9個土壤樣本中茶園土壤細菌群落種群分布相對較為穩定,3座茶山現代茶園和古茶園土壤優勢菌門變形菌門的平均相對豐度為51.30%和40.92%,其次為酸桿菌門19.61%和19.78%、放線菌門5.46%和7.19%、厚壁菌門4.42%和3.16%與擬桿菌門1.26%和6.03%,此5個菌門相對豐度之和分別為82.48%和77.08%,低于森林土壤5個菌門相對豐度之和的91.86%。表明,植茶和植茶年齡的增加將促進土壤細菌群落優勢種群的形成,構成茶園土壤特殊的微生物環境。

表5 不同土壤細菌在門水平上的分布統計Table 5 Soil bacterial communities at the phylum level

2.3 不同土壤細菌在目水平上的最佳物種分類及聚類分析

為了確定最佳的物種分類水平,統計了9個土壤樣品在各個分類水平上的tag序列數及物種分類單元(從上往下)為：界(100%)>門(92.87%)>綱(83.70%)>目(76.76%)>科(44.58%)>屬(10.11%)>種(2.00%)。圖1為9個樣品測序量的OTU稀釋曲線及樣品間bray距離層級聚類,間接反映樣品中物種的豐富程度以及在OTU水平上各樣品的相似性。從圖1可知,景邁山森林(J1)和南糯山森林(N1)及現代茶園(N2)土壤的OTUs指數(即物種豐富程度)明顯低于其他土壤,同時景邁山森林(J1)及古茶園(J3)土壤的OTUs指數(即細菌數量)明顯低于其他茶山土壤。布朗山3種土壤(B1、B2和B3)與景邁山現代茶園(J2)土壤細菌群落的物種結構比較相似,而景邁山森林(J1)和南糯山古茶園(N3)土壤的細菌種群結構與其他土壤差異性最大(圖1)。

圖1 各土壤細菌在97%相似性的OTU稀釋曲線圖及OTU的bray距離聚類分析圖Fig.1 Rarefaction curve at 97% similarity and clustering analysis of OTUs by bray distance

圖2是最佳分類水平(目)的物種表達譜熱圖,它展示了不同的物種在樣本間的表達變化情況,熱圖上的聚類關系,也可以反應樣本關系。本研究在目最佳分類水平上總共檢測到89個土壤細菌目,它們從屬于17個菌門。由于涉及細菌群落的種類很多,圖2僅對物種至少在一個樣本中包含tags數量達到總tags數量的1%作為閾值的43個目進行作圖。結果表明,變形菌門的伯克霍爾德氏菌目(Burkholderiales)和根瘤菌目(Rhizobiales)為森林(J1、B1和N1)、現代茶園(J2、B2和N2)及古茶園(J3、B3和N3)的優勢菌目,其在9個土壤樣品中的平均豐度分別達13.91%和8.17%,此外,Ellin329、黃單胞菌目(Xanthomonadales)、紅螺菌目(Rhodospirillales)、紅細菌目(Rhodobacterales)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)、柄桿菌目(Caulobacterales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、奈瑟菌目(Neisseriales)和粘球菌目(Myxococcales)的平均豐度分別達6.09%、4.52%、4.40%、3.64%、2.69%、2.20%、1.98%、1.82%和1.56%,變形菌門這11個目的累計平均豐度為50.99%；其次,酸桿菌門的酸桿菌目(Acidobacteriales)、Solibacterales、Ellin6513和iii1-15,其平均豐度分別為9.00%、4.62%、3.64%和1.67%；第三,厚壁菌門的芽孢桿菌目(Bacillales)和乳桿菌目(Lactobacillales)平均豐度分別為4.60%和1.67%,放線菌門的放線菌目(Actinomycetales)和酸微菌目(Acidimicrobiales)則分別為3.46%和1.39%,擬桿菌門的擬桿菌目(Bacteroidales)為2.09%。目最佳分類水平上樣品間物種表達聚類結果與圖1 OTUs最佳分類水平上的聚類分析結果相一致。

圖2 目分類水平各土壤細菌群落結構Fig.2 Soil bacterial communities at order level

圖3 各土壤細菌OTU相對豐度的PCA分析Fig.3 PCA analysis of the soil bacterial communities based on the relative abundance of OTU

此外,本研究以OTUs為指標對9個土壤樣本進行PCA統計分析(圖3),表明：9個土壤PC1=47.62%,PC2=15.97%,布朗山森林(B1)、現代茶園(B2)、古茶園(B3)和景邁山現代茶園土壤(J2)與其他5種土壤細菌種群結構差異可以區分開,南糯山古茶園土壤(N3)也明顯區別于其他4種土壤,同理,同一座山不同類型茶園間土壤細菌種群結構也存在明顯差異。與此同時,OTUs的PCA分析土壤樣本間的相互關系,與上述OTUs最佳分類水平聚類分析(圖1)和熱圖上的物種表達譜的聚類分析(圖2)結果相一致。

3 討論

茶樹是廣泛適應于熱帶亞熱帶酸性土壤的作物,鄧欣等[30]和王秀青等[18]采用稀釋平板涂抹法等對茶園土壤微生物的數量研究表明,茶園土壤的微生物數量普遍高于森林、農田和旱地土壤。薛冬等[3]采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)研究龍井茶產地梅家塢不同茶園、荒地和林地利用方式的土壤微生物群落基因多樣性指數表明：荒地 >茶園 >林地。秦紅靈等[6]采用RT-PCR分析對紅壤坡地不同土地利用方式對土壤細菌數量及結構的影響也表明,茶園 >自然恢復區(不耕種、不施肥,植被自然演替)>農田,茶園土壤細菌數量豐富,并保持較高的多樣性。本研究通過對3座茶山森林、現代茶園和古茶園土壤的細菌宏基因組16S rDNA測序及OTUs分子生物信息分析表明：9種土壤樣本的細菌數量及Shannon指數、ACE指數、Chao1指數(表4)均為：古茶園 >現代茶園 >森林,說明茶園土壤的細菌種類普遍增加,古茶園土壤細菌多樣性相對現代茶園更為豐富,與前人的研究結果基本一致。這可能與茶樹長期栽培下,茶園土壤中茶樹凋落物、根系分泌物及茶園施肥等使茶園土壤pH值變化及肥力提高(表2)[3-4,14-16,21]及古茶園林下栽培模式下良好的生態環境[18]更有利與茶園土壤細菌的繁衍與生存。

目前國內針對茶園土壤的微生物群落結構的基因組學研究較少,僅盧開陽等[20]采用平板涂布分離法和16S rRNA基因序列分析鑒定南糯山古茶樹和臺地茶根際土壤細菌群落結構的多樣性表明：茶樹根際土壤細菌分屬于放線菌門、厚壁菌門和變形菌門,其中古茶樹生境分離到20個屬,臺地茶生境則為17個屬,在屬一級水平,古茶樹根際土壤細菌群落的多樣性和豐富度均高于臺地茶。本研究利用高通量測序技術對森林和茶園土壤細菌群落組成的分子生物信息分析表明：在門分類水平上,9個土壤樣本細菌共分屬于47個菌門,其中,變形菌門是森林、現代茶園和古茶園土壤的明顯優勢類群,平均豐度達50.63%,其次,酸桿菌門、放線菌門、厚壁菌門與擬桿菌門,它們和變形菌門相對豐度之和占森林、現代茶園和古茶園的91.86%、82.48%和77.08%。盡管,研究角度和方法不同,但研究結果之間具有很大的相似性,共同表明：茶樹栽培管理中,人為干預度較小的林下古茶園栽培模式土壤微生物多樣性和豐富度高于人為干預度較大現代茶園。

本研究中關于茶園土壤細菌群落的物種表達熱圖(圖2)說明：3座茶山土壤43個細菌目,從屬于9個菌門,其中變形菌門平均豐度達50.99%；其次為酸桿菌門、厚壁菌門、放線菌門及擬桿菌門。這一研究結果與常安然等[31]關于16S rDNA測序技術對煙草根際土壤細菌分類結構研究結果：煙草根際土壤共有25個菌門,其中變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、疣微菌門四類菌門占明顯優勢,變形菌門是最為豐富的土壤細菌類群,在不同土壤類型中豐度占39.04%—53.71%相似。此外,國內關于森林及農田土壤細菌多樣性的測序研究[32-33]也表明,土壤中優勢細菌門為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、厚壁菌門和芽單胞菌門。與其他作物栽培的土地利用方式相比,茶樹作為高酚酸含量及根系分泌酚酸較高的多年生作物[3-4],其生物學特性和耕作制度對土壤細菌優勢群落在門水平沒有顯著的影響。但是,從OTUs物種注釋聚類分析(圖1)和PCA統計結果(圖3)則表明,每座茶山森林、現代茶園和古茶園3種土壤類型的細菌群落結構是有明顯的差別的。Meta-群落假說認為[34],細菌群落分布主要受內部環境和外部環境兩類作用因子的影響,且本土環境特征是調節細菌組成與分布的主要因素。為揭示茶園土壤環境因子和細菌群落組分的內在聯系,在今后研究中需要在明確季節、茶園土壤水分、pH值、有機質及速效氮磷鉀等因素對細菌群落的影響[6,14-15,31]外,還要進一步擴大茶園土壤微生物研究區域范圍、提高土壤微生物基因組的測序深度及物種注釋與分類水平,在屬或種水平上探明茶園土壤細菌種群結構,才能闡明茶園土壤細菌對土壤環境質量的調控機制。此外,本研究僅對細菌群落進行分析,對于茶園土壤其他種類的微生物類群,如真菌、古菌等的分布結構,還有待于進一步研究。

4 結論

1)土壤細菌16S rDNA高通量測序表明：森林、現代茶園和古茶園土壤細菌群落的平均覆蓋率分別為93.59%、87.05%和71.22%,Shannon指數平均分別為5.32、7.03和8.03,表明3座茶山不同土壤的細菌群落豐度為：古茶園 >現代茶園 >森林。

2)在門分類水平上,變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、厚壁菌門與擬桿菌門是森林、現代茶園和古茶園土壤的優勢類群,它們的相對豐度占比分別達91.86%、82.48%和77.08%；在目最佳分類水平上,變形菌門的伯克霍爾德氏菌目、根瘤菌目為森林和茶園土壤的優勢菌種,其平均豐度分別達13.91%和8.17%。

3)3座茶山3種土壤類型的最佳分類水平(目)和OTUs指數PCA統計分析均表明：森林、現代茶園和古茶園土壤類型的細菌群落結構差異明顯,除景邁山外,古茶園土壤細菌群落的多樣性和豐度均高于森林和現代茶園。