QuEchERS-HPLC-MS/MS 法測定檳榔中42種農藥殘留①

龔 敏 孫慧潔 張春冬

(海南省現代農業檢驗檢測預警防控中心 海南?？?70100)

檳榔果實（Areca seed），又名賓門、仁頻、榔玉等，是棕櫚科常綠植物檳榔的成熟種子。由于檳榔含有獨特的植物化學成分，有抗抑郁、降血壓、抗炎、抗氧化、抗血栓等藥理作用［1]，臨床上對治療疳癥、積滯、痢疾、便秘、小兒感冒等兒科疾病均有療效［2-4]。檳榔為海南農民脫貧致富的主要經濟作物之一［5]。近幾年來檳榔炭疽病、果腐病、煤煙病、黃化病等［6-7]病蟲害嚴重影響了海南檳榔的產量。目前較有效的檳榔病蟲害防治方法之一是噴灑農藥。但農藥的使用在防治檳榔病蟲害的同時也會影響檳榔的質量安全，檳榔農藥殘留的檢測是保障檳榔質量安全的手段之一。

據文獻記載，目前農藥殘留檢測常用的方法有：氣相色譜法（GC）［8-9]、氣質聯用法（GCMS）［10-11]、液 相 色 譜 法（LC）［12]和 液 質 聯 用 法（LC-MS/MS）［13-14]。農藥殘留質譜測定通常與色譜分離技術聯用，以同時提供保留時間、質荷比和離子豐度信息，是目前農藥多殘留分析方法的主導技術和未來發展趨勢，該技術在農藥殘留檢測中得到了廣泛的開發與應用。液相色譜—質譜法（LC-MS）是液相色譜和質譜的有機結合，高分離性能的液相色譜可用于檢測極性強和熱穩定性差的農藥成分［15]，質譜具備高選擇性、高靈敏度的特點，因此能對復雜基質中的農藥殘留進行檢測［16]。

串聯質譜多反應檢測模式（MRM）的HPLC-MS/MS［17-18]因具有更好的靈敏度和準確性而被廣泛地應用于農藥多殘留檢測技術中。本研究基于傳統的QuEChERS 法并進行改進優化，結合串聯質譜多反應檢測模式（MRM）的HPLC-MS/MS 法，建立了檳榔中42種農藥多殘留的定性、定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

日本島津公司生產的Nexerax2 型超高效液相色譜儀；美國AB 公司生產的AB SCIEX QTRAP 550 三重四級桿質譜儀；杭州佑寧公司生產的MIX-2500混合儀；Thermo 科技公司的高速冷凍離心機；梅特勒托利多公司的ME-203/02電子天平；德國默克公司的水純化系統。

德國MERCK 公司的乙腈，甲醇，甲酸，乙酸，乙酸銨（色譜純級別）；上海安譜的尼龍過濾膜（0.22 μm）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配置

所用的吡蟲啉、三唑磷等42 種農藥標準品均來自農業農村部環境保護科研監測所，濃度均為100 μg/mL。準確吸取各標準溶液0.1 mL，用乙腈定容至100 mL，得到濃度為0.1μg/mL 的混合標準溶液。檢測時，再用檳榔空白基質溶液分別配制成2、5、10、20、50 ng/mL 的基質混合標準工作溶液。

1.2.2 樣品前處理

將新鮮檳榔鮮果樣品于-18℃以下冷凍至脆，高速粉碎機破碎，剪碎其纖維；準確稱取5 g（精確至0.01 g）至50 mL 具塞離心管中，加入一定量的超純水浸潤水化30 min，再加入20 mL 1%乙酸-乙腈，渦旋震蕩5 min；加入6 g MgSO4，1.5 g 乙酸鈉，渦旋混合1 min，8000 r/min 離心10 min，取0.5 mL 上清液與0.5 mL 超純水混勻過濾膜（0.22 μm）待測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：phenomenex Kinetex 50 mm×3.0 mm，2.6 μm，填料為C18；柱溫：40℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：2 μL；流動相：A，0.1%甲酸-0.005 mol/L乙酸銨水；B，乙腈。洗脫條件見表1

表1 液相色譜洗脫條件

1.2.4 質譜條件優化

離子源：電噴霧離子源（ESI）；離子源溫度350℃；離子源電壓5500V；正離子掃描；數據采集運用多反應檢測模式（MRM）；CUR氣簾氣：30 psi，GS1噴霧氣：50 psi；GS2（輔助加熱器）：55 psi。

2 結果與分析

2.1 樣品處理方法的優化

2.1.1 提取溶劑的選擇

提取溶劑一般根據待測樣品和農藥成分的特性進行選擇，農藥殘留分析常用的提取溶劑有甲醇、丙酮、乙酸乙酯和乙腈［19]。本研究對甲醇、丙酮、乙酸乙酯和乙腈4種有機溶劑進行了實驗考察。結果表明：乙腈作為一種極性有機溶劑，能夠產生很好的相分離作用。本實驗的樣品為檳榔鮮果，其含有大量的纖維，水分較少，為使樣品在試劑中分布均勻從而達到充分提取的目的，加入提取溶劑前先加入一定量的水進行浸潤水化，再在乙腈中加入1%的乙酸可使樣品提取液處于平衡緩沖狀態，從而提高并穩定回收率。因此，本實驗選擇1% 的乙酸乙腈溶液作為提取溶劑。

2.1.2 凈化條件的選擇本試驗分別考察了QuEchERS 的前處理方法中加PSA和不加PSA 的凈化效果。結果表明，使用PSA 對樣品進行凈化時，PSA 在吸附極性雜質的同時也會對某些農藥成分有不同程度的吸附；不加PSA 時，雖然一定程度上存在雜質干擾和基質效應，但目標農藥成分也可完全分離，回收率也能滿足實驗需求。因此本研究基于QuEchERS 前處理方法進行改進，省去PSA過程，直接提取分層后的上清液，與超純水混勻后過膜上機檢測。

2.2 儀器條件的優化

2.2.1 色譜條件優化

本研究分別考察了流動相A（水、0.1%甲酸水溶液、5mmol/L 乙酸銨、0.1%甲酸水溶液和5 mmol/L 乙酸銨混合水溶液）以及流動相B（乙腈、甲醇溶液）對峰形、響應值等影響。結果表明，以流動相A（0.1%甲酸水溶液和5 mmol/L乙酸銨混合水溶液）及流動相B（乙腈溶液）作為流動相時峰形更好，響應值更高。42種農藥的MRM總離子流色譜圖詳見圖1。

2.2.2 質譜條件的確定

ESI 正離子模式下，采用針泵流動注射進樣方式對42 種農藥的混合標準品進行Q1 SCAN，先確定待測物的分子離子質荷比，找到目標化合物母離子；再通過Product Ion Scan，確定子離子的質荷比。通過選出的母、子離子，組建MRM離子對，對化合參數CE、DP 進行優化，同時對離子源參數（氣簾氣、離子化電壓、溫度、噴霧氣等）進行優化，建立MRM 模式下42 種農藥的掃描方法，詳見表2。

表2 MRM模式下42種農藥的掃描參數

續表2 MRM模式下42種農藥的掃描參數

續表2 MRM模式下42種農藥的掃描參數

2.3 方法評價

2.3.1 線性范圍和檢出限

分別配制了2、5、10、20、50 ng/mL 的42 種系列基質混合標準工作溶液，在優化好的儀器工作條件下依次進樣，分別以峰面積Y為縱坐標，濃度值X為橫坐標，繪制標準曲線。由表3 可知，42種農藥的質量濃度在2～50 ng/mL，濃度與峰面積呈良好的線性關系，相關系數（r）均高于0.999，符合《實驗室質量控制規范》（GB/T 27404-2008）中對校準曲線相關系數不低于0.99的要求。

通過檢測檳榔空白基質中添加已知低濃度農藥參數的樣品和檳榔空白基質樣品的測量信號進行比較，考察檢出限，檢出限為信噪比（S/N）的3 倍，通過檢測計算，本方法農藥多殘留的檢出限在0.1～3.2 μg/kg，詳見表3。

2.3.2 精密度和回收率試驗

本實驗用篩選好的檳榔樣品空白基質進行加標回收與精密度試驗，添加低、中、高3 個水平（10、50、100 μg/kg）進行LC-MS/MS 分析，計算平均回收率和精密度，每個添加濃度做6個平行試驗，用于考察本方法的回收率和精密度，結果見表3。

由表3 可知，3 個添加水平下，42 種農藥的平均回收率范圍為75.9%～105.6%，相對標準偏差小于13.4%，表明該方法有較高的精密度和準確度，滿足實驗室檢測中對靈敏度、精準度、準確度及重復性、穩定性的要求。

3 結論

通過調研，選取檳榔種植過程中使用較為普遍的農藥，建立了檳榔中42 種農藥多殘留的檢測方法，該方法采用改進優化的QuEChERS 前處理方法，并利用液相色譜－串聯質譜進行分析測定。結果表明：該QuEChERS-液相色譜－串聯質譜法操作簡便、高效、準確且重現性好，具有較好的靈敏度、準確度和精密度，能滿足檳榔鮮果中農藥殘留的檢測要求，適用于食用檳榔鮮果中農藥殘留含量測定。