溴鼠靈對斑馬魚的急性毒性效應研究

王帥 應劍波 王斌杰 王繼業 姚偉宣 吳元釗

摘要 [目的]研究溴鼠靈對斑馬魚的生態毒性效應。[方法] 在2 h內將受精后6 d的斑馬魚幼魚暴露在不同濃度的溴鼠靈溶液中，計算溴鼠靈對斑馬魚幼魚的半數致死濃度，并記錄染毒后斑馬魚的運動軌跡。[結果] 2 h內溴鼠靈對斑馬魚幼魚的半數致死濃度（LC50）可達13.51 mg/L，表明溴鼠靈對斑馬魚幼魚具有顯著的急性毒性作用。光暗交替環境刺激下，隨著溴鼠靈濃度的升高，對斑馬魚幼魚的平均運動速度、加速度的抑制作用愈加顯著。當藥物濃度低于1.00 mg/L時，各試驗組斑馬魚幼魚的運動行為均未出現異常，當試驗進行至60 min，10.00、50.00和100.00 mg/L濃度組斑馬魚幼魚的運動能力顯著下降。隨著藥物濃度的升高，斑馬魚幼魚對強光刺激的應激反應受到顯著抑制，100.00 mg/L濃度組斑馬魚幼魚基本失去應激能力。[結論] 溴鼠靈在2 h內對斑馬魚幼魚具有顯著的急性毒性作用，能夠顯著抑制其運動行為。

關鍵詞 溴鼠靈;急性毒性;斑馬魚;運動行為

中圖分類號 X503.225文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2020）24-0102-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.24.028

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Acute Toxicity of Brodifacoum to Danio rerio

WANG Shuai1， YING Jianbo2， WANG Binjie1 et al

（1.Zhejiang Police College， Key Laboratory of Drug Prevention and Control Technology of Zhejiang Province， Hangzhou，Zhejiang 310051; 2. Institute of Criminal Science and Technology Public Security Bureau of Hangzhou， Hangzhou，Zhejiang 310004）

Abstract [Objective] To investigate the ecotoxicological effects of brodifacoum on Danio rerio. [Method] The larvae of D. rerio were exposed to brodifacoum solution at different concentrations within 2 hours. The median lethal concentration of brodifacoum to D. reriolarvae was calculated， and the locomotor behavior of zebrafish after exposure was recorded. [Result] LC50 of brodifacoum to zebrafish larvae was 13.51 mg/L within 2 hours， which indicated that brodifacoum had significant toxicity to D. rerio larvae. Under the conditions of light dark alternation， with the increase of brodifacoum concentration， the inhibition of the average velocity and acceleration of D. rerio larvae gradually increased. When the concentration of brodifacoum was lower than 1.00 mg/L， there was no abnormal behavior of D. rerio in each experimental group， but the motor behavior of D. rerio decreased significantly in the concentration groups of 10.00，50.00 and 100.00 mg/L（P < 0.05）when the experiment lasted for 60 minutes.Moreover， with the increase of brodifacoum concentration， the stress response of D. rerio larvae to the strong light stimulation was significantly inhibited， and D. rerio in 100.00 mg/L treatment group almost lost the stress ability. [Conclusion]Brodifacoum had significant acute toxic effect on D. rerio larvae within 2 hours， and it could significantly inhibit the motor behavior.

Key words Brodifacoum;Acute toxicity;D. rerio;Motion behavior

近年來，毒鼠強、氟乙酰胺等急性強效殺鼠劑逐漸被禁用，目前較常見的殺鼠劑主要是第二類抗凝血殺鼠劑。與第一類抗凝血類殺鼠劑相比，第二代抗凝血殺鼠劑的毒性更強，毒力持續時間長，因此在農業生產中得到了廣泛使用[1-2]。此類殺鼠劑的大量使用可能導致部分藥物殘留進入土壤、水體等環境中，引發水資源污染、食品污染等一系列問題，進而危害水生生物甚至人類的生命健康[3]。以溴鼠靈為代表的第二代抗凝血類殺鼠劑對環境造成的污染問題越來越嚴重，也逐漸引起人們的重視。茅海瓊等[4]首次研究溴鼠靈在水環境突發性污染事故中的痕量殘留，采用超高效液相色譜串聯質譜法進行檢測，其檢出限可達0.08 μg/L。宓捷波等[5]建立了蔬菜及水果中溴鼠靈高效液相色譜-質譜分析方法，檢出限可達0.5 μg/kg。

溴鼠靈（brodifacoum）又稱大隆、溴鼠隆，是第二類抗凝血殺鼠劑的典型代表，也是目前應用最廣泛的殺鼠劑，其中文名稱為3-[3-（4′-溴聯苯-4-基）-1，2，3，4-四氫-1-萘

基]-4-羥基香豆素，屬于4-羥基香豆素類衍生物殺鼠劑[6]。與其他抗凝血類殺鼠劑作用機制類似，當溴鼠靈進入機體后，阻礙肝臟合成凝血酶原及一些凝血因子在肝臟的合成，造成各個臟器及黏膜大量出血而死亡[7-8]。由于使用不當、誤食而引起的抗凝血類殺鼠劑的中毒事件屢見報道[9-10]，在國內甚至出現了利用抗凝血類殺鼠劑進行投毒的案件[11]。目前，針對溴鼠靈等抗凝血類殺鼠劑的研究主要集中在中毒案例的救治[12-13]、生物樣品中藥物的檢測等領域[3，14-15]，目前尚缺乏能在短時間內實現對溴鼠靈等抗凝血類殺鼠劑的快速、有效且準確的檢測方法。因此，有必要開發高效、快速、靈敏的針對溴鼠靈急性毒性檢測手段，為及時、有效地預防和預警此類事件提供必要的技術支持和數據支撐。

斑馬魚（Danio rerio）是近年來新興的模式動物，其基因與人類具有80%以上的高度同源性，并且具有成本低、通量高、試驗周期短、靈敏度高、毒性生理指標豐富等優點[16]，被國際經濟合作組織（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）列為實驗室測試的推薦實驗物種。我國也出臺了《水質物質對淡水魚（斑馬魚）急性毒性測定方法》將斑馬魚應用于水質檢測。目前，國內外越來越多的學者以斑馬魚為模型開展藥物篩選[17-18]、化合物毒性評估[19-20]、環境監測[21-22]等領域的研究。Rihel等[23]首次利用斑馬魚模型的行為學參數實現了神經毒性化合物的篩查，在對明暗交替環境刺激模式下的斑馬魚運動行為參數分析后，從5 648個化合物中篩選出對斑馬魚有神經毒性的化合物547個。筆者以斑馬魚為實驗動物，研究2 h內溴鼠靈暴露對斑馬魚幼魚的急性毒性以及溴鼠靈對斑馬魚幼魚運動行為的影響，建立短時間內溴鼠靈斑馬魚的中毒模型，以期為短時間內溴鼠靈毒性評估提供試驗數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

試驗所用的親代斑馬魚均購自中國科學院水生生物研究所國家斑馬魚資源中心，自繁的第一代用于試驗，在自動水循環養殖系統中進行養殖，水環境電導率400～540 μS/cm，pH 7.0～7.6，水溫（28.0±0.5）℃。魚缸和過濾墊每周清理1次，去除糞便，飼養光周期控制光暗比為14∶10。每天10∶00和15∶00分別投喂鮮活豐年蝦餌料1次。

E3培養液的配制：分別稱取NaCl 17.2 g、KCl 0.76 g、CaCl2 2.91 g、MgSO4·7H2O 4.9 g，用雙蒸水溶解后配制成1 L的E3培養液。常用試劑購自國藥集團化學試劑有限公司，4 ℃ 下保存，14 d內使用。溴鼠靈標準品由杭州市公安局刑事科學技術研究所提供。因溴鼠靈微溶于水，20 ℃時在水中的溶解度僅為10 mg/L。試驗前，用二甲基亞砜（DMSO）將溴鼠靈配制成母液，逐級稀釋到所需試驗濃度，暴露溶液均為現配現用，確保各濃度組DMSO最終體積分數小于0.5%，對照組DMSO體積分數為0.5%（經預試驗可知，當DMSO體積分數為0.5%以下的處理與空白組處理無顯著差異，對胚胎期斑馬魚的發育以及幼魚的運動行為均無影響）。

主要儀器設備有Lab Tower EDI純水系統（美國賽默飛世爾公司）、恒溫培養箱（上海龍躍儀器設備有限公司）、DanioVision行為觀測系統（荷蘭諾達思信息技術公司）、電子分析天平（德國賽多利斯公司）、ZW-H3000體式顯微鏡（中國深圳中微科創公司）等。

1.2 實驗動物

試驗前12 h，選擇6～12月齡的健康性成熟斑馬魚按照雌雄1∶2的比例放置在孵化盒中，用透明玻璃板將雌、雄斑馬魚分隔開，在黑暗安靜環境下放置14 h。次日早晨，將雌、雄斑馬魚中間隔板抽離并給予光照刺激，使雌、雄斑馬魚在光照刺激下進行交配產卵，約0.5 h后收集受精卵。用 E3培養液沖洗受精卵2～3次去除雜質，6 h后在體視顯微鏡下觀察去除未受精以及形態有缺陷的胚胎，挑選出正常發育的斑馬魚胚胎于28 ℃恒溫培養箱中控光培養用于試驗。

1.3 急性毒性試驗

參考國際經濟合作組織（OECD）魚類急性水生毒性試驗設計暴露試驗，急性毒性試驗采用6孔板，每孔內放置30尾6日齡（6dpf）幼魚，每孔加注溴鼠靈溶液6 mL，溴鼠靈濃度設置為0.01、0.10、1.00、10.00、50.00、100.00 mg/L。加魚、加藥時間控制在10 min內，試驗開始后記錄2 h內斑馬魚幼魚的死亡數量，根據試驗需要可適當調節濃度設置，以便于計算半數致死濃度（LC50），拍照并記錄染毒后幼魚的形態變化。

1.4 運動行為試驗

斑馬魚幼魚的運動行為學試驗溴鼠靈濃度設置為0.01（Ⅰ）、0.10（Ⅱ）、1.00（Ⅲ）、10.00（Ⅳ）、50.00（Ⅴ）、100.00 mg/L（Ⅵ），每個濃度組隨機選擇12尾6日齡斑馬魚幼魚放入96孔板中，每孔1尾，將96孔板置于斑馬魚行為觀測系統箱體內。參考Mcgrath[24]報道的采用光暗交替刺激條件，系統設置10 min光照、10 min黑暗的明暗交替模式，循環6次，共記錄2 h內斑馬魚幼魚的運動軌跡，受試魚在試驗前適應10 s。主要測試斑馬魚幼魚在2 h內的自由運動行為。使用EthoVision XT 14軟件分別記錄各濃度組幼魚的運動軌跡，計算運動的總距離、平均速度、運動熱圖以及各濃度組藥物毒性起效時間、受強光刺激后的運動加速度等行為參數。

1.5 強光刺激應激試驗

藥物濃度設置、孔板選用及加藥方式均與斑馬魚運動行為試驗設置一致。參考文獻[25]報道的強光刺激試驗方法，并進行適當調整：在斑馬魚幼魚染毒60 min 后開啟強光照射刺激，采集并記錄第59～61 min斑馬魚幼魚的運動速度和加速度。

1.6 數據統計與分析

試驗數據使用SPSS 23.0統計軟件對濃度與致死率進行回歸分析，計算出溴鼠靈對斑馬魚的半數致死濃度（LC50）以及胚胎孵化率等指標，根據單因素方差分析（ANOVA）法比較暴露組與對照組間各觀測指標的差異顯著性，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。數據繪圖均使用Origin 8.5 軟件。

2 結果與分析

2.1 溴鼠靈對斑馬魚的急性毒性效應

如表1所示，對照組斑馬魚幼魚在整個試驗過程中全部存活，且運動行為無異常。0.01和0.10 mg/L濃度組斑馬魚幼魚在整個試驗過程中均未出現死亡，運動行為無顯著異常。1.00 mg/L濃度組斑馬魚在試驗進行至92 min出現死亡，2 h最終死亡率為6.6%;10.00 mg/L濃度組斑馬魚在試驗進行至74 min出現死亡，2 h最終死亡率為16.6%;50.00 mg/L濃度組斑馬魚在試驗進行至62 min出現死亡，2 h最終死亡率為63.3%;100.00 mg/L 濃度組斑馬魚在試驗進行至54 min出現死亡，2 h 最終死亡率為100%。根據試驗數據計算可知，2 h內溴鼠靈對斑馬魚幼魚的半數致死濃度（LC50）為13.51 mg/L。

由圖1可知，相對于對照組（CK），0.01（Ⅰ）、0.10 mg/L濃度組（Ⅱ）幼魚均保持存活，且在形態上并無明顯變化，從1.00 mg/L（Ⅲ）開始，10.00（Ⅳ）、50.00（Ⅴ）和100.00 mg/L（Ⅵ）濃度組均出現死亡，隨著濃度的升高，死亡幼魚的體形輪廓逐漸不清晰，且體軸出現彎曲。

2.2 溴鼠靈暴露對斑馬魚運動行為的影響

行為學測試記錄了在明暗交替刺激條件下不同濃度的溴鼠靈暴露2 h后6日齡斑馬魚幼魚的總運動距離（圖2A）、運動平均速度（圖2B）、運動行為熱區圖（圖2C）。如圖2所示，與對照組相比，Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組斑馬魚幼魚的總移動距離、平均運動速度均顯著下降（P<0.05），幼魚的運動行為能力受到顯著抑制（圖2A、圖2B）。在待測濃度范圍內，隨著溴鼠靈濃度的升高，幼魚的總移動距離、平均運動速度總體上呈現抑制作用。值得注意的是，Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組斑馬魚幼魚的移動總距離和平均速度呈現逐漸上升的趨勢，這是因為在試驗20 min內高濃度組斑馬魚受到溴鼠靈的刺激更為劇烈，因此總移動距離和平均速度的累積值會有一定程度的異常。圖2C為斑馬魚幼魚的運動熱圖。根據系統設置，幼魚正常游動軌跡顏色設置為藍色，隨著幼魚游動軌跡的重復，其顏色不斷加深，其軌跡疊加顏色由藍色逐漸變為黃色，運動軌跡最密集區域則顯示紅色。該試驗結果顯示，在2 h內Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組紅色區域較為集中，說明高濃度組的斑馬魚幼魚大部分時間停留在固定區域，高濃度溴鼠靈對斑馬魚幼魚的行為能力具有顯著的抑制作用。

為便于分析染毒時間對斑馬魚幼魚行為運動的影響，分析了在光暗環境刺激下溴鼠靈染毒后斑馬魚幼魚運動平均速度隨時間的變化情況（圖3A）以及前60 min和后60 min平均運動速度的變化情況（圖3B）。如圖3A所示，對照組（CK）和各濃度組斑馬魚幼魚的運動平均速度均呈現逐漸下降趨勢，其中Ⅰ組（0.01 mg/L）與Ⅱ組（0.10 mg/L）斑馬魚的運動平均速度在試驗進行30 min后逐漸趨于平穩，Ⅳ、Ⅴ與Ⅵ組斑馬魚的運動平均速度呈現急劇下降趨勢，并在試驗進行至大約60 min后，Ⅵ組斑馬魚運動速度首先趨于0，此后Ⅳ、Ⅴ組也逐漸趨于0。為更加直觀地研究藥物毒性作用，分析了前60 min和后60 min斑馬魚運動平均速度的變化情況。如圖3B所示，在試驗開始的60 min內各濃度組斑馬魚的運動平均速度變化并不顯著，但在后60 min內每個濃度組斑馬魚的運動平均速度與其前60 min相比顯著下降，Ⅳ、Ⅴ與Ⅵ組斑馬魚的運動速度與前60 min相比均顯著下降，且隨著濃度的升高，其下降程度更加顯著。

2.3 溴鼠靈暴露對斑馬魚幼魚強光應激能力的影響

圖4為59～61 min不同濃度溴鼠靈染毒對斑馬魚幼魚強光刺激驚恐應激能力的影響。圖4A顯示，與59～60 min暗環境下平均速度相比，60～61 min強光刺激環境下平均速度均不同程度下降，隨著藥物濃度的升高，平均運動速度的下降程度逐漸降低。如圖4B所示，相對于CK，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組的運動加速度均大幅度降低，尤其是Ⅵ組其運動加速度較CK下降了600%。單位時間內的速度變化以及加速度的變化表明，斑馬魚幼魚在強光刺激下的應激能力隨著藥物濃度的升高呈顯著下降的趨勢。

3 討論

第二代抗凝血殺鼠劑是慢性殺鼠劑，主要通過競爭性抑制肝臟中維生素K的轉化使凝血功能受損，從而達到毒殺的效果。它們對鼠的毒殺作用雖然高，但作用較為緩慢，投藥后死亡高峰期在第3～5天[26]。已報道的人類抗凝血類殺鼠劑中毒案例中，中毒后出現凝血障礙臨床表現出血有一定的潛伏期，延遲幾小時甚至幾天[27]。該研究結果顯示，Ⅲ（1.00 mg/L） 組斑馬魚在試驗進行至92 min出現死亡，Ⅳ（10.00 mg/L）組斑馬魚在試驗進行至74 min出現死亡，Ⅴ（50.00 mg/L）組斑馬魚在試驗進行至62 min出現死亡，Ⅵ（100.00 mg/L）組斑馬魚在試驗進行至54 min出現死亡。該研究建立的斑馬魚中毒模型可在2 h內對溴鼠靈毒性進行應激反應，表明第二代抗凝血類殺鼠劑對斑馬魚具有顯著的急性毒性，2 h內半數致死濃度（LC50）可達13.51 mg/L。相較于前期學者建立的犬類等動物的中毒模型，具有時間更短、敏感性更強等特點[28]。

模式動物的運動行為已被廣泛用于測試環境化學品的神經毒性。高濃度溴鼠靈暴露會影響斑馬魚的運動總距離、平均運動速度等運動行為，并對強光刺激的逃避反應也產生一定的影響。此前未見有學者研究溴鼠靈等抗凝血類殺鼠劑對斑馬魚的運動行為產生影響的報道。逯南南等[29]研究表明絕大部分農藥類化學品對魚類具有神經毒性，當暴露濃度達到一定值時魚類的運動行為受到明顯抑制，平均運動速度等受到顯著抑制。該研究將染毒后斑馬魚的行為運動能力引入急性毒性考察，在低濃度（0.01和0.10 mg/L）組斑馬魚幼魚的運動總距離和平均運動速度與對照組相比無顯著變化，而10.00、50.00和100.00 mg/L濃度組斑馬魚的運動總距離和平均運動速度及其對強光逃避的應激能力均具有顯著的抑制作用。目前，關于溴鼠靈染毒后引起斑馬魚神經損傷的具體機理尚不明確，需進一步研究。

4 結論

以斑馬魚為研究對象，初步建立了短時間內溴鼠靈斑馬魚中毒模型。通過測定2 h內的LC50，評價了溴鼠靈對6日齡斑馬魚幼魚的急性毒性，溴鼠靈短時間暴露對斑馬魚具有顯著的急性毒性作用，2 h對斑馬魚幼魚的半數致死濃度可達13.51 mg/L。溴鼠靈暴露對斑馬魚的運動總距離和平均運動速度產生顯著的抑制作用，并對斑馬魚的強光逃避應激能力也具有顯著的抑制作用。該研究建立了基于斑馬魚的溴鼠靈中毒模型，獲取了2 h內溴鼠靈對斑馬魚幼魚的急性毒性、平均運動距離以及對強光刺激的應激反應等指標，可為深入研究第二代抗凝血類殺鼠劑、評價溴鼠靈的急性毒性提供科學依據。

參考文獻

[1] 韓奇杰，李凱平，賴躍，等.溴敵隆中毒研究進展[J].中國法醫學雜志，2012，27（6）：471-473.

[2] 董天義，閻丙申.抗凝血滅鼠劑研究進展[J].醫學動物防制，1998，14（4）：61-67.

[3] 宋薇，楊柏崇，趙永彪，等.QuEChERS-UPLC-MS/MS測定果蔬中4種殘留抗凝血殺鼠劑[J].食品科學技術學報，2014，32（3）：65-71.

[4] 茅海瓊，應紅梅，朱麗波，等.超高效液相色譜串聯質譜法測定4種抗凝血滅鼠劑在水環境突發性污染事故中的痕量殘留[J].分析化學，2010，38（9）：1382.

[5] 宓捷波，張駿，王云鳳，等.蔬菜、水果中4種抗凝血滅鼠劑殘留的高效液相色譜-串聯質譜法測定[J].分析測試學報，2008，27（11）：1214-1216，1220.

[6] 鄭衛青，陳陵，陳海嬰，等.美國滅鼠劑應用概述[J].中華衛生殺蟲藥械，2013，19（3）：255-257.

[7] 肖雪花，陳湛.薄層色譜法快速鑒定中毒樣品中的敵鼠鈉、溴敵隆、溴鼠隆、殺鼠迷、殺鼠靈[J].中國衛生檢驗雜志，2010，20（12）：3203-3204.

[8] STAFFORD D W.The vitamin K cycle[J].Journal of thrombosis and haemostasis，2005，3（8）：1873-1878.

[9] 肖康.466例急性農藥中毒病人流行病學分析[D].衡陽：南華大學，2019.

[10] 李敏，王巖，杜艷秋.抗凝血類滅鼠藥中毒20例救治及護理[J].中國工業醫學雜志，2019，32（6）：508-509.

[11] 汪曉華，陳曉軍.溴敵隆食物中毒176例診治分析[J].中國全科醫學，2010，13（15）：1674-1675.

[12] 邱男，張謙，曾德珍，等.抗凝血滅鼠藥中毒救治21例分析[J].浙江臨床醫學，2009，11（7）：714-715.

[13] 王臻，劉忠文，張茵，等.抗凝血滅鼠劑中毒導致獲得性維生素K依賴性凝血因子缺乏癥——46例臨床分析[J].血栓與止血學，2011，17（4）：166-168，182.

[14] 朱琳，向平.生物樣品中抗凝血類殺鼠劑分析研究進展[J].復旦學報（醫學版），2015，42（5）：663-669.

[15] 王璞，周麗屏，郭嘉明，等.高效液相色譜法測定全血中5種抗凝血類滅鼠劑[J].中國職業醫學，2016，43（2）：210-213.

[16] MCGRATH P，LI C Q.Zebrafish：A predictive model for assessing druginduced toxicity[J].Drug discovery today，2008，13（9/10）：394-401.

[17] 王成，龔莉虹，郭朝成，等.模式生物斑馬魚在中藥藥效物質篩選中的應用進展[J].中草藥，2019，50（24）：6125-6134.

[18] MORBIATO E，BILEL S，TIRRI M，et al.Potential of the zebrafish model for the forensic toxicology screening of NPS：A comparative study of the effects of APINAC and methiopropamine on the behavior of zebrafish larvae and mice[J].NeuroToxicology，2020，78：36-46.

[19] 林濤，陳燕秋，陳衛.水體中磺胺嘧啶對斑馬魚的生態毒性效應[J].安全與環境學報，2014，14（3）：324-327.

[20] 賀凱宏，尚楠，陳建平，等.納米氧化鋁對斑馬魚幼魚早期運動行為的影響[J].生態毒理學報，2018，13（3）：165-171.

[21] 周斯蕓，張瑛，魏倡，等.四溴雙酚A對斑馬魚游動行為的毒性效應研究[J].安全與環境學報，2016，16（1）：387-391.

[22] 張雅晶，繆恒鋒，張曉夏，等.市政污水處理廠二級出水消毒前后對斑馬魚幼魚的毒性[J].生態毒理學報，2018，13（5）：208-217.

[23] RIHEL J，PROBER D A，ARVANITES A，et al.Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation[J].Science，2010，327（5963）：348-351.

[24] MCGRATH P.Zebrafish：Methods for assessing drug safety and toxicity[M].Hoboken，NJ：John Wiley & Sons，Inc.，2011.

[25] DIPP V R，VALLES S，ORTIZKERBERTT H，et al.Neurobehavioral alterations in zebrafish due to longterm exposure to low doses of inorganic Arsenic[J].Zebrafish，2018，15（6）：575-585.

[26] 熊孟韜.第二代抗凝血滅鼠劑應用概況[J].醫學動物防制，2001，17（6）：327-331.

[27] CARAVATI E M，ERDMAN A R，SCHARMAN E J，et al.Longacting anticoagulant rodenticide poisoning：An evidencebased consensus guideline for outofhospital management[J].Clinical toxicology，2007，45（1）：1-22.

[28] 杜志國，王建琳，黃凱，等.犬抗凝血滅鼠藥中毒模型的建立及犬新鮮冰凍血漿治療效果分析[J].中國獸醫雜志，2018，54（9）：37-39，42.

[29] 逯南南，宋武昌，王明泉，等.馬拉硫磷急性暴露對斑馬魚的行為毒性研究[J].生態毒理學報，2017，12（4）：249-254.