以L-蘇氨酸為發酵底物的2,5-二甲基吡嗪高產菌株構建

曹艷麗，張麗杰，徐巖*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine，2,5-DMP)是一種含氮雜環化合物(圖1)，作為重要的風味化合物廣泛存在于傳統發酵食品和熱處理食品中，例如白酒[1-3]、醬油[4-6]、發酵的可可粉[7-8]、燒烤的牛肉[9]、種子[10]以及花生[11]等，主要貢獻食品中的烤花生香氣[12-13]，是我國GB2760—1986中規定允許使用的香精物質。2,5-DMP具有極低的閾值，在食品中添加1～2 μg/kg，就可以起到明顯的增香作用[14]。此外，2,5-DMP還是一種重要的醫藥中間體——5-甲基吡嗪-2-羧酸的重要合成原料[15]。目前，國內外對于2,5-DMP的合成主要采用化學方法，但化學合成往往存在嚴峻的環保問題，且產品不是天然的。作為具有增香作用的食品添加劑，生物法生產的2,5-DMP明顯更受消費者喜愛，且價格更高。

L-蘇氨酸是一種可廣泛應用于食品、藥品、飼料添加等方面的常用氨基酸，微生物發酵法生產L-蘇氨酸的工藝簡單，成本低廉，是目前通用的生產方法[16-18]。近年來，國內外大型企業，如中國梅花、日本味之素、德國德固賽等公司逐漸增加產能(100余萬t)，導致L-蘇氨酸產能逐漸過剩，市場飽和，產品價格呈下降趨勢。因此，將產能過剩的低值生物基化學品高值化[19]，如構建新的以L-蘇氨酸為底物的高值生物化學品2,5-DMP生產菌種及方法，是緩解L-蘇氨酸產能過剩,實現2,5-DMP生物法生產的有效思路。

在之前的研究工作中，本課題組篩選得到1株可以利用L-蘇氨酸為底物生產2,5-DMP的野生型菌種，經鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，且已成功解析B.subtilis利用L-蘇氨酸為底物生產2,5-DMP的合成機制(未發表)。如圖1所示，在B.subtilis中，微生物利用L-蘇氨酸脫氫酶(L-threonine dehydrogenase,TDH)為唯一關鍵酶，后經過一系列非酶催化反應生成2,5-DMP。然而，該菌種產量、產率均過低，難以滿足工業化生產需要。2,5-DMP作為一種重要的食品級風味化合物，其生產菌株的安全性至關重要。B.subtilis為美國食品和藥物管理局(food and drug administration,FDA)認定的安全菌種(generally recognized as safe,GRAS)[20]，有潛力作為食品級化合物生產宿主。另外，B.subtilis易培養、繁殖快、易保存，具有良好的發酵基礎和生產技術[21]，是原核表達系統中外源蛋白表達較理想的宿主之一[22]。B.subtilis168具有更為清晰的遺傳背景及較強的遺傳操作可行性。因此，本研究以B.subtilis168為出發菌株，篩選不同種屬來源的TDH，在獲得外源表達具有高效催化活力的TDH工程菌株的基礎上，外源表達NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)，以促進輔因子循環，最終構建得到1株可利用L-蘇氨酸為底物高產2,5-DMP的基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox，首次實現了從L-蘇氨酸到2,5-DMP的高效生物轉化。該工作一方面緩解了L-蘇氨酸產能過剩的困境，另一方面有機會獲得國際認可的“nature flavor”[23]高值風味化合物產品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

本研究所用菌株和質粒見表1。

1.1.2 主要試劑與儀器

2，5-DMP標準品，Sigma-Aldrich (美國)；限制性內切酶(NdeI，EcoR I，BamH I)、In-Fusion HD Cloning Kit、PrimerSTAR Max DNA Polymerase等分子操作所用酶，寶生物工程(大連)有限公司；溶菌酶、硫酸卡那霉素及氨芐青霉素，生工生物工程(上海)股份有限公司；E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit等分子操作所用試劑盒，Omega Bio-Tek (美國)；其他試劑均為國產或進口分析純。

PCR 儀，Bio-Rad；核酸電泳儀，北京六一儀器廠；凝膠成像儀，美國ProteinSimple；多功能酶標儀，Thermo Scientific公司；高效液相色譜儀，Agilent 1200；超高效液相色譜儀，Waters；超聲波細胞破碎儀，Scientz。

注：Ampr：氨芐青霉素抗性；Kanr：硫酸卡那霉素抗性。

1.1.3 培養基及緩沖液

LB培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L；固體LB培養基加入2%瓊脂。

LBT培養基：LB培養基添加5 g/LL-蘇氨酸。添加方法如下：配制50 g/L的L-蘇氨酸母液，使用無菌水系濾膜(0.22 μm)過濾除菌后，添加5 mL至無菌濃縮LB培養基中(121 ℃，20 min)，培養基中最初的L-蘇氨酸濃度以實際檢測濃度為準。在菌株構建和發酵過程中，抗生素的添加量為氨芐青霉素100 μg/mL，硫酸卡那霉素50 μg/mL。

PBS緩沖液：50 mmol/L Na2HPO4溶液與50 mmol/L NaH2PO4溶液適量混合，調至pH 8.0。

1.2 TDH過表達菌株的構建

1.2.1 TDH過表達質粒的構建

NCBI查找獲取分屬于7種不同種屬菌株的TDH編碼基因：Bacillussubtilis168、BacilluslicheniformisATCC 14580、BacillusamyloliquefaciensDSM7、Pseudomonasputida、EscherichiacoliK-12、Aspergilluscandidus、Aspergillusuvarum(見表2)。由于P.putida、E.coli K-12、A.candidus及A.uvarums四株菌株的基因組DNA無法獲取，且胞內密碼子偏好性可能與本研究使用的宿主菌B.subtilis有一定差距，因此，本研究采用全基因合成結合密碼子優化方法獲取該4株菌株的TDH編碼基因tdh。針對B.subtilis168、B.licheniformisATCC 14580、B.amyloliquefaciensDSM7三株菌株的基因tdh的獲取，本研究首先分別提取3株菌株的基因組[24]。

以各菌株基因組DNA為模板，分別以B.subtilis168-tdh-F/R、B.licheniformisATCC 14580-tdh-F/R和B.amyloliquefaciensDSM7-tdh-F/R為引物(表3)，通過PCR擴增獲得相應各菌種基因tdh。PCR反應體系：2×PrimerSTAR Max DNA Polymerase 25.0 μL，引物F和R (20 μM)各1.0 μL，基因組DNA模板2.0 μL，無菌水21.0 μL。PCR 反應條件：98 ℃，3 min；[98 ℃，30 s；55 ℃，15 s；72 ℃，80 s]，30個循環；72 ℃，10 min。

質粒pMA0911進行雙酶切(37 ℃,30 min)，酶切位點為NdeI/EcoR I。PCR擴增產物和與酶切的質粒pMA0911經膠回收純化后使用In-Fusion HD Cloning Kit進行連接(50 ℃，15 min)。將連接產物轉入E.coliDH5α感受態細胞中，通過氨芐青霉素抗性(100 μg/mL)篩選陽性克隆子。挑取克隆子提取質粒，通過酶切和測序驗證陽性克隆子的正確性。

1.2.2 TDH過表達菌株的構建

將構建成功的重組質粒轉化至B.subtilis168感受態細胞中，B.subtilis168感受態的制備和轉化方法詳見參考文獻[24]。利用硫酸卡那霉素抗性(50 μg/mL)篩選陽性轉化子，對挑取的陽性轉化子進行菌液PCR驗證。所用鑒定引物為pMA0911-F/R (表3)，PCR反應體系：2×PrimerSTAR Max DNA Polymerase 12.5 μL，引物F和R (20 μmol/L)各0.5 μL，基因組DNA模板1.0 μL，無菌水10.5 μL。PCR 反應條件：98 ℃，3 min；[98 ℃，30 s；55 ℃，15 s；72 ℃，115 s]，30個循環；72 ℃，10 min。

1.3 TDH和NOX共表達菌株的構建

1.3.1 重組質粒pMA0911-tdh(E.c)-nox的構建

通過基因合成獲取重組質粒pMA0911-nox，以此質粒為模板，設計引物nox-F/R (表3)，通過PCR擴增獲得相應的基因nox，PCR反應體系同1.2.1，PCR反應條件：98 ℃，3 min；[98 ℃，30 s；55 ℃，15 s；72 ℃，90 s]，30個循環；72 ℃，10 min。PCR擴增產物和酶切質粒pMA0911-tdh(E.c)(EcoR I/BamH I，37 ℃,30 min)經膠回收純化后使用In-Fusion HD Cloning Kit進行連接(50 ℃，15 min)。將連接產物轉入E.coliDH5α感受態細胞，通過氨芐青霉素抗性(100 μg/mL)篩選陽性克隆子，提取質粒，通過酶切和測序驗證其正確性。

1.3.2 TDH和NOX共表達菌株的構建

方法同1.2.2。

1.4 發酵實驗

將構建成功的基因工程菌株在硫酸卡那霉素(50 μg/mL)抗性LB平板上進行活化，37℃過夜培養，挑取單菌落至LB液體培養基(50 μg/mL 硫酸卡那霉素)，37 ℃，200 r/min 培養12 h，轉接250 mL搖瓶(含有一定濃度L-蘇氨酸的LBT培養基50 mL，50 μg/mL硫酸卡那霉素)進行發酵，24 h后取樣，測定在600 nm處的吸光度值OD600，然后計算出2,5-DMP和L-蘇氨酸的濃度。

1.5 2,5-DMP濃度測定

2,5-DMP采用超高效液相色譜進行定量測定，所用流動相A為0.1%(體積分數)甲酸溶液，流動相B為色譜級甲醇。流動相體積分數梯度變化為：初始，31% B；0～3 min，31%～69% B；3.10 min，31% B；運行時間為10 min。流速為0.2 mL/min，色譜柱為Waters BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)，采用二極管陣列檢測器(photo-diode array,PDA)檢測器，檢測波長為275 nm。

1.6 L-蘇氨酸濃度測定

L-蘇氨酸的濃度采用鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde,OPA)柱前在線衍生-高效液相色譜進行測定。所用流動相A為乙酸鈉緩沖液(55 mmol/L,pH 7.2)，流動相B為乙酸鈉緩沖液(275 mmol/L,pH 7.2)∶色譜級甲醇∶色譜級乙腈=1∶2∶2(體積比)。流動相梯度變化為：初始，8 % B；0～23 min，8%～52.3% B；23～23.5 min，52.3%～100% B；23.5～26.5 min，100% B；26.5～28 min，100%～8% B；運行時間為30 min。流速為1 mL/min，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，采用紫外檢測器，檢測波長為338 nm。

1.7 菌體生長密度測定

取0.2 mL發酵液，使用蒸餾水進行4倍稀釋，測定 600 nm 波長下的吸光值(無菌培養基作為空白對照)。

1.8 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析

取2 mL發酵液進行離心(12 000 r/min,5 min)，利用0.85%(質量濃度)的NaCl溶液對菌體洗滌2次。用1 mL PBS緩沖液懸浮菌體至OD600為3.0，加入20 μL溶菌酶(母液質量濃度為20 mg/mL)，于37 ℃水浴放置1 h，取出懸浮菌液置于冰上。利用超聲波細胞破碎儀對菌體進行破碎(時間1 min；功率36%)，對破碎液離心(12 000 r/min,5 min)，取上清進行適當稀釋至蛋白終質量濃度為0.8 mg/mL。蛋白含量采用Bradford法進行測定[25]。SDS-PAGE上樣預處理：取30 μL稀釋液加入10 μL的4×蛋白質SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻后放置沸水中10 min，隨后進行離心(12 000 r/min,10 min)。取20 μL上清液進行上樣，最終獲得SDS-PAGE圖。

2 結果與分析

2.1 不同來源的TDH表達載體的構建

前期研究表明，B.subtilis合成2,5-DMP的途徑中，TDH為唯一關鍵酶，催化L-蘇氨酸生成2-氨基乙酰乙酸，后者進行一系列非酶促反應最終生成2,5-DMP。因此，以2,5-DMP野生合成菌種為出發菌種，過表達TDH，理論上可以進一步提高2,5-DMP產量，且不同來源的TDH可能具有不同的催化活性。因此，本研究計劃以B.subtilis168為出發菌種，首先選取不同種屬來源的TDH，并分別外源表達，通過檢測2,5-DMP產量，來篩選具有催化優勢的TDH，并獲得2,5-DMP增產菌種。

通過在NCBI查找，確定了7種不同種屬來源的TDH編碼基因tdh(表2)：B.subtilis168、B.licheniformisATCC 14580、B.amyloliquefaciensDSM7、P.putida、E.coliK-12、A.candidus、A.uvarums。分別提取B.subtilis168、B.licheniformisATCC 14580、B.amyloliquefaciensDSM7全基因組，并以此為模板分別進行TDH編碼基因tdh的克隆。選用B.subtilis外源表達質粒pMA0911為載體，雙酶切(NdeI/EcoR I)后的質粒與PCR擴增的TDH編碼基因tdh(圖2-A)經膠回收純化后進行連接，構建TDH表達重組質粒(圖2-B)。另外，因P.putida、E.coliK-12、A.candidus、A.uvarums四株菌株的基因組難以獲得，因此對上述4種菌株的TDH編碼基因tdh密碼子優化后進行全基因合成，并構建到表達載體pMA0911上。

對構建的重組質粒(圖2-B)進行雙酶切(NdeI/EcoR I)驗證，酶切結果如圖2-C所示，各酶切片段長度與表4中一致，表明TDH編碼基因tdh成功與表達載體連接。為了進一步確定基因序列的正確性，將酶切結果正確的重組質粒進行測序，測序結果與原有序列進行比對，確定序列一致，表明各個來源的TDH編碼基因tdh未發生突變，不同來源的TDH表達載體pMA0911-tdh構建成功。

2.2 TDH表達菌株的構建及發酵驗證

將驗證正確的7種不同種屬來源的TDH表達載體pMA0911-tdh分別轉入B.subtilis168感受態中，對陽性轉化子進行菌液PCR驗證，結果如圖3所示，與理論上的PCR產物長度一致(表5)。表明以B.subtilis168為宿主，7種不同種屬來源的TDH外源表達菌株構建成功。

對構建成功的工程菌株進行發酵驗證，在含有5.83 g/L的L-蘇氨酸的LBT液體培養基中發酵24 h，測定細胞生長量(OD600)、生成的2,5-DMP和消耗的L-蘇氨酸。結果如圖4所示，各基因工程菌的OD600無明顯差別(圖4-B)，不同種屬來源的TDH外源表達菌株積累2,5-DMP能力具有顯著性差異，來源于E.coliK-12的TDH外源表達菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)利用L-蘇氨酸消耗量最高，積累2,5-DMP質量濃度最高，發酵24 h后，2,5-DMP的積累量高達527.43 mg/L。而來源于P.putida、A.candidus與A.uvarums的TDH外源表達菌株2,5-DMP積累量并無明顯提高。

本研究對各基因工程菌株中TDH的表達情況進行了SDS-PAGE分析。如圖5所示，來源于B.subtilis168、B.licheniformisATCC 14580、B.amyloliquefaciensDSM7和E.coliK-12的TDH成功表達，該結果與基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(B.s)、B.subtilis168/pMA0911-tdh(B.l)、B.subtilis168/pMA0911-tdh(B.a)和B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)利用L-蘇氨酸產2,5-DMP的能力與對照菌株(B.subtilis168/pMA0911)相比顯著提高的實驗結果相一致(圖4)。然而，如圖5所示，基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(P.p)、B.subtilis168/pMA0911-tdh(A.c)和B.subtilis168/pMA0911-tdh(A.u)的細胞破碎液并未顯示明顯的TDH目的蛋白條帶，與上述菌種利用L-蘇氨酸產2,5-DMP的產量與對照菌株相比變化不大的實驗結果相一致(圖4)。雖進行密碼子優化，但菌種P.putida、A.candidus及A.uvarums與宿主B.subtilis親緣關系相距較遠，可能導致目的蛋白TDH表達量較低甚至沒有表達。

本研究的目的是獲得1株可以利用L-蘇氨酸高產2,5-DMP的基因工程菌株，因此，基于圖4所示結果，本研究選擇B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)作為后續菌株構建的基礎菌種。

2.3 TDH與NOX共表達載體的構建

由圖1所示，TDH為2,5-DMP合成過程中的唯一關鍵酶，其催化L-蘇氨酸與NAD+生成2-氨基乙酰乙酸及NADH。因此，在2,5-DMP合成過程中，輔酶NAD+的含量可能是制約2,5-DMP產量的重要因素(圖1)。雖然細胞在正常情況下可以實現自身還原力平衡，但在本研究中，由于TDH的過量表達，可能會使得NAD+過度消耗而難以實現快速再生，影響TDH的催化效率。因此，本研究計劃外源表達NADH氧化酶NOX，后者可以催化NADH生成NAD+和水，以實現NAD+的快速再生[26]。

因B.subtilis外源表達質粒選擇有限，因此本研究決定將NOX編碼基因nox與TDH編碼基因tdh在同一質粒轉錄表達。首先通過全基因合成獲取攜帶NOX轉錄基因nox的質粒pMA0911-nox(圖2-B)，并以此為模板，擴增出攜帶質粒pMA0911同源臂的目的基因nox(圖6-A)，將基因nox構建到酶切質粒pMA0911-tdh(E.c) (圖6-A)，重組質粒pMA0911-tdh(E.c)-nox示意圖如圖6-B所示。將構建好的重組質粒轉入E.coliDH5 α感受態中進行克隆，對重組質粒進行酶切驗證，結果如圖6-C所示，各酶切片段長度與表4中一致。為了進一步確定基因序列的正確性，將酶切結果正確的重組質粒進行測序，經過比對進一步確定了序列一致且讀碼框正確。以上結果說明，雙基因共轉錄質粒pMA0911-tdh(E.c)-nox構建成功。

2.4 TDH與NOX共表達菌株的構建及發酵驗證

將重組質粒pMA0911-nox和pMA0911-tdh(E.c)-nox分別轉入B.subtilis168感受態中，對陽性轉化子進行菌液PCR驗證，所用驗證引物為pMA0911-F/R (表3)，結果如圖7所示，各菌株的菌液PCR產物長度如表5所示，經比對可以確定NOX表達菌株和TDH與NOX共表達菌株構建成功。

對構建成功的基因工程菌株進行發酵驗證，在含有蘇氨酸終質量濃度為5.83 g/L的L-蘇氨酸的LBT液體培養基中發酵24 h，對細胞生長量(OD600)、生成的2,5-DMP以及消耗的L-蘇氨酸進行測定，結果如圖8所示。

從圖8可以看出，雖然菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox的細胞生長量略低于菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)(圖8-B)，但對于2,5-DMP的積累量卻高于菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)，且具有顯著性差異(圖8-A)，而2菌株對于L-蘇氨酸的消耗量并不具有顯著性差異(圖8-B)。因此，NOX的存在對于過表達的TDH催化L-蘇氨酸最終生成2,5-DMP有促進作用。菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox利用5.83 g/L的L-蘇氨酸發酵24 h，最終2,5-DMP的產量可達616.04 mg/L,與對照菌株B.subtilis168/pMA0911相比(圖4-A)，產量提高了22.5倍，與基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)相比，產量增加了88.61 mg/L。有文獻報道，B.subtilis利用40 g/L的L-蘇氨酸發酵15 d，最終積累2,5-DMP的量為560 mg/L[27]，與之相比，本研究構建得到的基因工程菌B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox利用L-蘇氨酸生物轉化為2,5-DMP的效率大大提高。

對基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-nox中NOX的表達情況和B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox中TDH和NOX共表達情況進行SDS-PAGE分析,如圖9所示。

基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-nox的破碎液中顯示出NOX外源表達目的條帶?；蚬こ叹闎.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox的細胞破碎液中，均顯示出TDH及NOX外源表達目的條帶，表明該菌株中TDH及NOX均表達，與基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox具有更高的2,5-DMP產量結果相一致(圖8)。

基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-nox利用L-蘇氨酸產2,5-DMP的能力遠低于B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox(圖8-A)，分析其原因，在TDH表達水平不高的情況下，細胞自身的還原力水平足以維持菌株自身的TDH催化所需要的還原力，也就是說，即使還原力水平提高，但是在催化過程中真正需要的還原力水平并沒有提高，因此，該菌株B.subtilis168/pMA0911-nox對于2,5-DMP的積累量接近于對照菌株B.subtilis168/pMA0911 (圖4-A)。

3 結論與討論

來源于E.coliK-12的TDH在B.subtilis168中可以過表達，并且該蛋白的過表達更有利于B.subtilis168利用L-蘇氨酸合成2,5-DMP。在TDH過表達的基礎上，NOX的參與可以促進NAD+的快速再生，從而有助于促進2,5-DMP產量的提高。本研究成功構建得到1株可以利用L-蘇氨酸高產2,5-DMP的基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(E.c)-nox，該菌株可以在添加5.83 g/L的L-蘇氨酸的LBT液態培養基中發酵24 h，便可積累616.04 mg/L 2,5-DMP，與對照菌株B.subtilis168/pMA0911相比，產量提高了22.5倍。與此前報道的B.subtilis利用40 g/L的L-蘇氨酸發酵15 d，最終積累560 mg/L 2,5-DMP[27]相比較，該基因工程菌株利用L-蘇氨酸生物轉化為2,5-DMP的效率大大提高。該研究對于工業上實現2,5-DMP的生物合成具有重要意義。

與野生菌株相比，雖然構建的基因工程菌株利用L-蘇氨酸生物轉化為2,5-DMP的效率大大提高，但其轉化率仍僅有23.3%。在L-蘇氨酸的微生物代謝中，有3條重要的途徑，分別起始于3種關鍵酶：TDH、L-蘇氨酸醛縮酶及L-蘇氨酸脫水酶(L-蘇氨酸脫氨酶)[28-29]，即L-蘇氨酸在菌株中的代謝流向不止TDH所在的一條途徑。另外，2-氨基-3-酮丁酸CoA連接酶可以催化2-氨基乙酰乙酸(TDH催化L-蘇氨酸形成的產物，圖1)進入甘氨酸代謝途徑[30]，從而使得流向2,5-DMP的生成方向受阻。因此，本研究構建的基因工程菌株利用L-蘇氨酸生產2,5-DMP的轉化率仍不高。為了進一步提高轉化率，后續可以通過無痕基因敲除手段切斷L-蘇氨酸其他的代謝途徑，使得L-蘇氨酸盡可能多地流向2,5-DMP的生成方向。