黑曲霉Aspergillus niger NCUF413.1對特香型白酒釀造出酒率和風味的影響

潘菲，董彪，劉婷，陳妍，陳可丹，黃冰靜，萬茵，劉成梅，張鵬，付桂明*

1(食品學院食品科學與技術國家重點實驗室(南昌大學)，江西 南昌，330047)2 (江西省樟樹市樟樹貢酒業有限公司，江西 樟樹，331200)

中國白酒是采用典型的同步糖化發酵的固態釀造方式生產，霉菌的糖化作用與淀粉原料的轉化息息相關。固態發酵對原料的利用率低，淀粉質原料的糖化發酵不完全，是造成白酒固態發酵產酒率較低的重要原因。大曲是白酒釀造過程中微生物主要來源之一[1]，其含有的大量霉菌能夠分泌多種淀粉酶、糖化酶等水解酶類[2]。這些酶能將淀粉水解成小分子糖，為酵母菌乙醇發酵及香氣物質的生成提供能量和小分子物質[3]，直接影響白酒出酒率和重要香氣物質的產生，對整個釀造過程產酒精和呈香有重要貢獻。米曲霉、河內白曲霉、黑曲霉和米根霉等霉菌是白酒生產中常用的霉菌，具有較高的糖化力[4-5]，同時其具有耐酸特性且能分泌較多酸性蛋白酶，能夠提高出酒率，已被廣泛應用于白酒釀造。

本文對特香型白酒大曲中的霉菌進行分離純化，篩選鑒定高產糖化酶霉菌，將其與釀酒酵母共同制備成麩曲強化大曲，接種于酒醅，按特香型白酒釀造工藝進行強化釀造，分析高糖化力霉菌對提高白酒固態發酵出酒率和原酒中風味物質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

特香型中溫大曲、大米、稻殼，江西樟樹貢酒廠有限公司。土豆、麩皮等，市購；淀粉、酵母膏、NaCl、NaOH、(NH4)2SO4、I2、KI、醋酸鈉、冰醋酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、Na2SO3、酒石酸鉀鈉等(國產分析純)；乳酸石炭酸棉藍染液,廈門海標科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒、Taq酶,天根生化科技(北京)有限公司；葡萄糖(BR純度),上海阿拉丁生化科技股份有限公司；瓊脂粉(AR純度),北京索萊寶科技有限公司；DNA Marker,寶日醫生物技術有限公司；4-甲基-2-戊醇,德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 培養基和菌種

PDA培養基：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮爛，用4層紗布過濾，加入葡萄糖和瓊脂，加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補足水分至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

糖化力初篩培養基：可溶性淀粉12 g，酵母膏8 g，NaCl 5 g，瓊脂 15 g，水1 000 mL。

麩皮培養基：新鮮麩皮10 g，加水15 mL，裝于250 mL三角瓶中，0.12 MPa高壓滅菌40 min，重復進行2次滅菌。

SaccharomycescerevisiaeNCUF303.1 為本實驗保存的高產酒精釀酒酵母。

1.3 儀器與設備

ZDX-35BI型坐式蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；HWS-250型恒溫恒濕培養箱,上海森信實驗儀器有限公司；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠；PCR儀，賽默飛世爾科技有限公司；7890-7000 GC-QQQ-MS，美國Agilent公司；57330-U SPME手柄、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷 固相微萃取纖維頭，美國Supelco公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 特香型白酒大曲中霉菌的分離純化[6]

將5 g大曲粉置于含有100 mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，稀釋涂布于PDA培養基上，置于28 ℃下恒溫培養2～3 d，將選中的菌落進行傳代培養，并通過反復劃線進行純化。

1.4.2 特香型白酒大曲中高糖化霉菌的篩選

將霉菌點種于初篩培養基，28 ℃培養2～3 d，向培養皿中加入適量顯色劑染色。靜置，測量平板中菌落和透明圈的直徑大小，計算水解圈(hydrolysis cirole,HC)值(HC=透明圈直徑/菌落直徑)，以HC值的大小作為衡量糖化力強弱的標準。

菌株經斜面活化后，用血球計數板計數后稀釋至孢子數達107CFU/mL,接種于麩皮培養基中，28 ℃培養72 h，采用DNS試劑法測定糖化酶酶活，采用Young J.Yoo改良法測定α-淀粉酶活[7]。

1.4.3 真菌菌落、生化鑒定

采用插片法對復篩霉菌的菌落形態進行顯微形態結構觀察，參照真菌分類鑒定手冊，初步確定菌株分類。

1.4.4 霉菌分子鑒定

采用真菌基因組DNA提取試劑盒步驟提取霉菌DNA。以上述提取的霉菌基因組DNA為擴增模板，進行PCR擴增，將PCR產物送往上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結果在GenBank上進行比對，鑒定種屬。

1.4.5 麩曲的制備應用分析

取篩選得到的高糖化力霉菌和實驗室保存的1株釀酒酵母，以麩皮培養基制備強化麩曲。根據酒廠的實際生產工藝，功能麩曲加入量占大曲總量13%，將其與粉碎的大曲一起添加到冷卻的糧醅中，其中曲占酒糟的比例為20%，加入后需充分攪拌均勻。其中實驗A組為霉菌和酵母共同添加，B組和C組分別添加霉菌和酵母，D組為對照組。

將不同實驗組應用于模擬特香型白酒釀造體系中，發酵周期為30 d，蒸餾得酒樣，并進行分析，釀酒實驗重復3次。

1.4.6 酒樣指標分析

(1)出酒率按照中國釀酒工業學會定義，按公式(1)計算:

(1)

式中：m,產50%(vol)酒樣質量,g;M,大米的質量，g。

(2)酒精度按照國標 GB 5009.225—2016測量酒樣的酒精度。

(3)揮發性成分分析

A.HS-SPME條件。取5 mL酒樣于頂空瓶中，添加10 μL 4-甲基-2-戊醇內標溶液，萃取參數分別為5%酒精度、0.2 g/mL NaCl、萃取溫度50 ℃、萃取時間30 min。萃取結束后，插入氣相進樣口熱解析5 min后拔出，并分析檢測。每個樣品平行3次。

B.GC-MS條件。氣相色譜柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：He；流速1 mL/min；分流比10∶1；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始。

質譜條件：電子能量70 eV，離子源EI，離子源溫度230 ℃，質量掃描范圍28～500 amu，掃描方式為全掃描。

C.酒樣揮發性成分RI和含量的測定。定性分析：將正構烷烴標準品液體進樣，按上述酒樣升溫程序進行分離，進樣量為1 μL，分流比為10∶1。根據每個正構烷烴出峰的保留時間來計算樣品組分峰的保留指數RI[8]。與質譜庫中的化合物進行匹配。定量分析：以內標物質(4-甲基-2-戊醇)的濃度、峰面積計算各揮發物的含量,重復測量3次。

2 結果與分析

2.1 糖化霉菌的分離、篩選

從73株霉菌菌株初篩出HC較大的14株霉菌，測定其糖化酶、液化酶酶活，結果如圖1所示。

由圖1可知，菌株NCU-69的糖化酶和液化酶酶活均高于其他菌株，液化酶活力最強為631.96 U/g，糖化酶活力為938.63 U/g，綜合考慮選定其為目標菌株。

2.2 糖化霉菌的鑒定

2.2.1 霉菌的形態及鑒定

利用插片法對其進行培養，利用乳酸石碳酸棉藍染液對其染色制片，在顯微鏡下觀察的菌株形態特征如圖2所示。

圖2顯示，從形態特征上，NCU-69菌落表面為黑褐色、粉末狀，菌落生長快；分生孢子頭的頂囊球形狀為近球形、黑褐色、呈放射狀排列，孢子呈鏈狀、布滿頂囊；分生孢子梗較長，表面光滑、無隔，這些都符合曲霉屬的形態特征。

2.2.2 菌種的分子生物學鑒定

將獲得的NCU-69菌株的DNA序列在NCBI數據庫進行比對，結合菌落形態和顯微形態，鑒定NCU-69為黑曲霉(Aspergillusniger)，命名為NCUF413.1。

2.3 糖化霉菌應用性能分析

2.3.1 糖化霉菌酒樣理化指標測定

將不同菌種組合麩曲強化大曲釀造的酒醅進行蒸餾，測酒樣酒精度折算成出酒率，結果如表1所示。

與對照組酒樣比較，A組出酒率由26.21%提高到34.35%。其原因可能是強化的A.nigerNCUF413.1和S.cerevisiaeNCUF303.1協同作用，強化的黑曲霉分泌糖化酶和液化酶加速了對原料糖化分解，被釀酒酵母利用轉化為酒精。B組單獨用A.nigerNCUF413.1強化出酒率比對照組提高0.8%，這是由于A.nigerNCUF413.1水解淀粉成小分子糖還原糖，在白酒釀造過程中，為酒醅中原有釀酒酵母乙醇發酵提供了還原糖[9]，從而提高了出酒率。而C組單獨用S.cerevisiaeNCUF303.1強化時，出酒率卻下降了，原因可能是強化了釀酒酵母，在釀造前期快速生成乙醇對霉菌的生長有抑制作用[10]，反而降低了淀粉的水解。

2.3.2 功能霉菌強化酒樣香氣成分測定

采用GC-MS對A組和對照組酒樣中的揮發性成分進行分析，酒醅固相微萃取物質質譜總離子流色譜圖如圖3所示。

將不同菌種強化酒樣依次測定揮發性成分，如圖3所示，3種強化酒樣與對照組酒樣總離子流色譜圖基本相似，各酒樣中揮發性成分峰形一致，說明不同酒樣中香氣成分種類基本一致。

對總離子流圖中的各峰與數據庫MPW2011和NIST11標準質譜圖庫進行比對，結合保留指數定性，不同菌種強化酒樣中揮發性成分的含量結果見表2。

由表2可知，經GC-MS從A、B、C和對照組酒樣中分別鑒定出67、66、66和67種揮發性成分，只有A組黑曲霉和釀酒酵母共強化的酒樣與對照組中揮發性成分種類完全一致。67種揮發性成分包括酸類物質2種，醇類物質9種，酯類物質36種，醛酮類物質16種，烴類化合物4種等。其中苯乙醇、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯乙酸苯乙酯、苯丙酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯、苯乙醛和3-糠醛的含量較高，其總離子流圖響應值明顯高于其他物質。相關的研究表明[37]，特香型白酒中的特征香型物質主要為奇數脂肪酸乙酯等酯類物質，如乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、棕櫚酸乙酯、癸酸乙酯等，這與本次研究結果相似。

注：n.d表示未檢出或含量較低，RI≥700開始檢測

白酒中酸類、醇類、酯類和醛酮類等眾多微量呈香物質是決定白酒風格和質量的關鍵因素。其中，酯類化合物是白酒產品中最重要的呈香物質之一，也是酒香濃郁的主要物質，酯類化合物在總揮發性物質中比例高低對白酒香味濃郁起重要作用。結果表明，A.nigerNCUF413.1強化可提高釀造的酒樣中總酯含量，單獨黑曲霉強化酒樣酯類化合物含量占總揮發性物質的70.11%，A組黑曲霉和釀酒酵母酒樣中酯類化合物含量占總揮發性物質的71.01%，均高于對照組的62.94%。A組酒樣中丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯等酯香風味物質的含量均高于對照組。HUANG Y等[38]從茅臺酒大曲中分離出一株黑曲霉，通過研究該菌蛋白酶對茅臺酒香氣的影響發現黑曲霉產酶能提高酒樣中醇和酯類的含量。

3 結論

從特香型白酒大曲中篩選得到1株高糖化酶力菌株A.nigerNCUF413.1，與S.cerevisiaeNCUF303.1共同制作強化麩曲，按特香型白酒釀造工藝進行強化釀造發現，出酒率由26.21%提高到34.35%，揮發性成分種類一致，其中丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯亞油酸乙酯、油酸乙酯等酯類化合物含量升高，其占總揮發性成分比例提高了8.07%。產糖化酶霉菌A.nigerNCUF413.1與釀酒酵母共同強化釀造，有助于白酒發酵中酯類物質的產生，提高出酒率，提高白酒酯香風味成分含量。