濃香型白酒窖泥香氣成分的空間分布規律

鄭佳，楊康卓，張建敏，劉芳，何張蘭，彭志云，趙東

(宜賓五糧液股份有限公司,四川 宜賓，644007)

“千年老窖萬年糟，酒好須得窖池老”，泥窖固態續糟發酵是濃香型白酒區別于其他香型白酒的根本特征之一。窖泥既是濃香型白酒功能微生物又是營養物質乃至香味物質的重要載體[1]，故可稱之為窖池發酵的菌源和香源。長期不間斷的發酵過程中，窖泥中微生物利用糟醅中的營養成分產生有機酸等香味物質，窖泥與糟醅之間的接觸有效實現了窖泥與糟醅物質與能量的互動[2-3]，而微生物的代謝功能強弱程度則是影響濃香型白酒酒質的關鍵因素之一。因此，研究窖泥中微生物與香味成分的構成及空間分布規律具有重要的理論與實際意義。

過去關于窖泥香氣成分的研究中，基于乙醇提取法的不同窖齡窖泥香氣成分的研究發現：仲丁醇含量隨窖齡增加而減少，而己醇、己酸乙酯和己酸異戊酯的含量則不斷增加，有機酸是任何窖齡窖泥中比例最高的化合物類型[2]；左飛等[3]利用高溫孵育-頂空法設計了一種窖泥香氣成分的定性方法；孫夏冰等[4]優化了頂空固相微萃取(head space solid-phase microextraction,HS-SPME)分析窖泥中揮發性成份的方法；范文來等[5]利用HS-SPME分析了人工窖泥中的揮發性成分，共檢出184種揮發性成分，其中酯類78種、酸類11種、醇類18種、芳香族26種以及內酯、呋喃、硫化物等。李恒等[6]比較了窖壁和窖底窖泥中香氣成分的差異，認為窖壁和窖底泥中酸類和酯類成分在種類和數量上均存在明顯差異，己酸、己酸丁酯、己酸己酯是窖壁泥的主要特征成分，而窖底泥中含有豐富的己酸甲酯。最近，趙東等[7]研究了以黃水線為分隔依據的5個不同位置糟醅與窖泥在香氣成分的關聯性。然而，窖泥中香氣成分的空間異質性特征的研究還亟待進一步詳細分析。

本研究采集了不同空間位置的濃香型白酒窖泥，探討了窖泥中香氣成分的空間分布規律；并基于多元統計分析方法探討了窖泥之間的相互關系，以期為科學認識窖泥對酒質的貢獻提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

窖泥采集自宜賓五糧液股份有限公司釀酒車間，窖池窖齡15年。

采集方法：參考文獻[8]所述方法，從地面開始，沿窖池壁往窖池底部垂直距離間隔30 cm取樣，利用專用窖泥取樣器撥開窖泥表面附著的糟醅后，從表層往里層取約3 cm厚度的窖泥，同一層次取3個平行樣(平行樣點分布在窖墻同一平面上，以窖墻中心點往兩邊間隔50 cm分別取樣)，分別取50 g，混合均勻。全部樣品包括0、30、60、90、120、150、180、210和240 cm共9個窖泥樣品。

樣品前處理參考文獻[8]所述方法，即取100 g窖泥置于-20 ℃中完全冷凍，再用攪拌機攪拌均勻，待測。

1.1.2 試劑和儀器

丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、乙酸、丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、丁醇、異戊醇、己醇、庚醇、辛醇、苯乙醇、苯酚和對甲酚，均為GC純，上海TCI公司。4-甲基吲哚和4-辛醇(GC純，內標)，美國Sigma-Aldrich公司。

50/30 μm CAR/DVB/PDMS Stableflex纖維萃取頭，美國Supelco公司；氣質聯用儀，7890B-5977B MSD，美國Agilent公司；多功能自動進樣器，PAL RTC，瑞士CTC公司；DB-WAX石英毛細管色譜柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)，J&W Scientific，美國Agilent公司。

1.2 頂空固相微萃取(HS-SPME)方法

參考文獻[7]所述方法。稱取2 g窖泥于20 mL頂空瓶中，加入定量內標(4-辛醇，5.5 mg)，50 ℃水浴中平衡15 min，再插入纖維萃取頭吸附萃取45 min，隨后導入GC進樣口中熱解析5 min，利用GC/MS分析其中香氣成分。每個樣品做2個重復。

1.3 氣質聯用(GC/MS)條件

氣相色譜條件為：進樣口溫度230 ℃，載氣(He)流速1 mL/min，不分流模式進樣，質譜連接線溫度250 ℃；升溫程序為：起始柱溫40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

質譜條件為：質譜EI源，電子轟擊能量70 eV；離子源溫度200 ℃，四級桿溫度150 ℃；質量數掃描范圍35～350 amu。

1.4 香氣成分的定量

香氣成分的定量采用內標法[7]測定，參考內標質量濃度，以待測成分與內標的峰面積之比計算待測成分的半定量信息，單位以μg/g表示。

1.5 數據分析

利用R軟件繪制主要香氣成分的熱圖；利用SIMCA 14.1軟件完成樣品的偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)[9]。

2 結果與討論

2.1 窖泥香氣成分的總離子流圖

實際生產中，在經歷長期不間斷的發酵后，不同空間位置的窖泥感官差異十分顯著；同時，在對窖壁和窖底窖泥香氣成分的比較研究中，酯類和酸類物質在兩者間的差異顯著[6]。為了更進一步認識窖泥中香氣成分的空間分布規律，本研究以30 cm為尺度，從窖池頂部到底部的9個不同位置進行取樣，利用HS-SPME-GC/MS分析了窖泥中香氣成分的空間分布情況。如圖1所示，窖泥中香氣成分的指紋圖譜存在高度相似性，但是在各成分的豐度存在顯著差異，如總離子流圖中16～20 min、27～40 min等區域在不同空間的窖泥中差異性顯著。

2.2 窖泥香氣成分的空間分布

2.2.1 分組分布規律

進一步統計窖泥香氣成分的分組空間分布規律，如圖2所示，窖泥香氣成分的總含量隨窖池深度增加而增加，窖池頂部(0 cm)的總含量為444 μg/g，而窖池底部(240 cm)的總含量是0 cm處的3.38倍，達到1 502 μg/g。一般地，濃香型窖池內90～120 cm是黃水線的位置，0 cm到90 cm/120 cm部分處于窖池上層，與窖泥接觸的糟醅的含水量較120 cm以下的糟醅低。酸類和酯類是窖泥中最主要的2種成分類型，含量范圍分別為：156.3～670.6 μg/g和153.3～649.9 μg/g，顯而易見，這2個最重要的成分類型的總含量隨窖池深度的增加而增加，而醇類成分的含量并未呈現顯著的空間異質性。這可能是由于窖池的特殊結構-即頂部較大、底部適當小的地穴式結構[10]，黃水是糟醅發酵過程中產生的副產物[11]，而窖池內不同空間層次的糟醅之間物質的交換主要是通過黃水在重力的作用下自然下滲，下層窖泥吸收與之接觸的糟醅中的香氣成分[12]，故下層窖泥香氣成分明顯高于中上層窖泥。

2.2.2 主要香氣成分的空間分布規律

篩選出窖泥中關鍵的香氣成分進行空間變化情況研究。由圖3可知，己酸、丁酸、庚酸、辛酸、己酸乙酯、己酸己酯是窖泥中含量較高的成分，這與先前的研究結果一致[7]?；谙銡獬煞趾康木垲惙治隹芍?圖3)，0～90 cm的窖泥樣品劃歸為第一類，120～240 cm的窖泥樣品劃歸為第二類。同時，第二類窖泥中己酸、丁酸、辛酸、庚酸、己酸己酯和己酸乙酯的含量普遍高于第一類。

特別是己酸、丁酸、己酸乙酯是濃香型白酒的主要的有機酸和乙酯成分[13]，分別具有典型的“酸味、臭腳丫味”和“菠蘿、類似香蕉”等復合香氣特征[14]。本研究中，除120 cm窖泥以外，這3種成分的含量隨窖池深度的增加而增加，尤其是窖池底部(240 cm)，含量達到最大值，分別為168.38、220.33和133.98 μg/g(圖3)，與過去研究結果相吻合[15]。這可能是因為：一方面，乙酸、己酸和丁酸等濃香型白酒中占優勢的有機酸是由窖泥中梭菌屬(Clostridium)[16]細菌代謝產生；另一方面，窖池內的厭氧程度也是隨著窖池深度而增加，為Clostridium細菌等厭氧菌群的增殖代謝提供了較為理想的環境，因而深度越深，己酸和丁酸的含量越高。

本研究中，不同空間窖泥中己酸、丁酸和乙酸的含量排序為己酸>丁酸>乙酸，這與過去關于不同質量等級窖泥的研究結果類似[15]，這可能是由于本研究中窖池窖齡在15年左右，屬于新窖向老窖老熟轉化的過程期，不同類型有機酸的含量隨窖池使用時間的增加而逐步調整。

此外，本研究中，醇類成分(除乙醇外)雖然不是窖泥中的優勢香氣成分，值得注意的是正己醇是醇類成分中含量最高的成分，含量范圍從0 cm處16.83 μg/g到240 cm處31.28 μg/g，但無顯著的增減規律。正己醇具有典型的“割青草”香氣，又具有一定的甜味，是濃香型白酒的重要醇類物質。

2.3 基于香氣成分的窖泥PLS-DA分析

為了進一步考察隨著窖池深度的變化，不同窖泥中香氣成分的差異以及樣品之間的關聯性。根據圖3的聚類分析結果，將不同空間的窖泥設置為不同的組別建立PLS-DA模型，觀察組間差異情況，并試圖探索與之關聯的關鍵香氣成分。PLS-DA模型R2值與Q2值越大,表明PLS-DA模型的預測能力越準確與真實[17]。本研究中，將0 cm與30～90 cm構建PLS-DA模型，以及將120 cm與150～240 cm所涉及的樣品建立PLS-DA模型，結果如圖4所示。圖4-a和圖4-b的R2Xcum與Q2cum分別為(0.951、0.994)和(0.905、0.877)，表明PLS-DA模型能真實反應窖泥樣品各組之間的分組情況。圖4-a和4-b中，基于t[1]和t[2]軸上的載荷值，不同空間位置窖泥能夠很好的分開，例如圖4-a中，30和60 cm處窖泥分別位于t[1]負半軸，而0和90 cm則分別位于t[1]正半軸。

通過PLS-DA的載荷圖尋找與各樣品關聯的差異性關鍵香氣成分(圖4-b和圖4-d)。圖4-b中，組別1(0 cm)窖泥與苯酚正相關，組別2(30和60 cm)窖泥與肉豆蔻酸乙酯、13-甲基肉豆蔻酸乙酯和辛酸己酯正相關，組別3(90 cm)窖泥與2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、乙酸和壬酸正相關；圖4-d中，組別1(240 cm)窖泥與2-乙基苯酚、癸酸丙酯、己酸己酯和異戊醇等正相關，組別2(210 cm)窖泥與(R)-(-)-2-戊醇、十三酸乙酯和乙酸正相關，組別3(120 cm)窖泥與己酸甲酯正相關，組別4(150和180 cm)窖泥與辛酸己酯、3-甲基丁酸辛酯和壬酸正相關。根據篩選的主要關聯香氣成分含量繪制熱圖，圖5-a中，0 cm窖泥中苯酚含量較高；肉豆蔻酸乙酯、13-甲基肉豆蔻酸乙酯和辛酸己酯在30和60 cm窖泥中含量較高；2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、乙酸(圖3)和壬酸在90 cm窖泥中的含量較高。圖5-b中，2-乙基苯酚和異戊醇在240 cm窖泥中含量最低，己酸己酯(圖3)和癸酸丙酯在240 cm窖泥中的含量較高；(R)-(-)-2-戊醇在210 cm窖泥中含量最低，十三酸乙酯和乙酸在210 cm窖泥中的含量較高；己酸甲酯在120 cm窖泥中的含量較高；辛酸己酯、3-甲基丁酸辛酯和壬酸在150和180 cm窖泥中含量較高。

3 結論

濃香型白酒發酵過程中，窖泥中不僅棲息了數以億計(109個/g)的特殊微生物，而且在糟醅與窖泥相接觸的界面，不斷地發生微生物、香氣物質等相互交換。本文探討了窖泥中香氣成分的空間分布規律，結果表明，窖泥中蘊含較高含量的有機酸，尤其是己酸、丁酸和庚酸，且窖池深度是決定有機酸含量的重要因素，深度越深，有機酸含量越高；同時，己酸己酯可能是窖泥中己醇和己酸在酯化酶作用下產生。因此，進一步利用基因組學技術與代謝組學技術研究窖泥微生物群落與窖泥特征香氣成分的關聯性研究將為優質窖泥的篩選及質量控制提供較強的理論及實踐基礎。