微量樣本中N-糖組分析技術的發展與應用

孟 波，李曉宇，崔新玲，應萬濤*，錢小紅1，*

(1.廣東藥科大學 藥學院，廣東 廣州 510006；2.軍事科學院軍事醫學研究院生命組學研究所，蛋白質組學國家重點實驗室，北京蛋白質組研究中心，國家蛋白質科學中心(北京)，北京 102206；3.北京工業大學 生命科學與生物工程學院，北京 100022)

蛋白質糖基化修飾是最常見的蛋白質翻譯后修飾(Protein post-translational modification,PTM)之一[1]，根據其連接的氨基酸不同分為N-糖基化修飾和O-糖基化修飾兩種[2]，其中N-糖基化修飾在蛋白質穩定性、蛋白質間信號傳導、細胞生長、蛋白質活性調節等方面起著重要的作用[3-4]，N-糖蛋白還是主要的腫瘤治療靶點和生物標志物來源，如前列腺癌中的前列腺特異性抗原 PSA[5]，卵巢癌中的腫瘤抗原CA125[6]，乳腺癌中的Her2/neu[7]和肝癌中的分子診斷標志物AFP[8]。N-糖基化修飾一直是單克隆抗體藥物質控、腫瘤標志物發現和臨床蛋白組學研究的熱點，但蛋白N-糖基化修飾微觀和宏觀的不均一性、樣本制備要求起始量高、糖鏈標準品缺少等原因，限制了糖組學的發展和應用?，F階段，N-糖組學樣品制備的常規過程，需經過蛋白的提取、變性、還原烷基化、蛋白消化、N-糖鏈的釋放及N-糖鏈的富集等多個步驟，容易造成糖鏈組分的損失。2014年Kulak等[9]研發了一種In-Stage Tip方法，用于在單個封閉空間內中進行蛋白樣品處理，該方法將樣品制備的多步驟合并成單一步驟用于蛋白質組學的研究，在一定程度上降低了蛋白樣品制備的起始量。2016年Chen等介紹了一種簡單和集成的基于Spintip的蛋白質組學技術[10],該技術較過濾輔助樣品制備(Filter-aided sample preparation，FASP)方法優化了蛋白樣品制備的實驗步驟，同時實現了肽段的梯度洗脫。雖然近年來蛋白質組學樣本制備方案有了很大的進步，但是將這些方案用在N-糖鏈的樣本制備上仍缺乏系統研究。液相色譜法和質譜法為目前常用的兩種N-糖鏈檢測技術。液相色譜法雖然可以很好地對N-糖鏈進行檢測，但操作時間長、N-糖鏈需求量高，需要大量的糖蛋白，在很多情況下難以獲取足夠的蛋白進行N-糖鏈的樣品制備，特別是對于臨床上的微量體液標本、病理切片、穿刺樣本等。因此，需要建立低損失的蛋白消化、N-糖鏈釋放和富集的一體化技術，結合快速靈敏的N-糖鏈分析方法以實現微量糖蛋白N-糖組分析。本研究嘗試建立了針對微量樣本的N-糖鏈制備技術(N-Glycan preparation technology,GPAT),用以降低N-糖組學研究的起始蛋白量。通過人免疫球蛋白G(IgG)和人肝癌HepG2細胞蛋白，驗證了GPAT對單純樣本和復雜樣本N-糖組分析的可行性，并進一步將此方法應用于6例健康人(3例男性，3例女性)的尿蛋白的N-糖組分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Ultraflex基質輔助激光解吸電離飛行時間串聯質譜儀(MALDI-TOF MS，美國Bruker公司)；離心機和冷凍干燥離心機(美國Thermo公司)；微型個人離心機-Multi Spin(日本TOMY公司)；JY 92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技公司)；親水相互作用色譜填料(HILIC)和反相色譜填料(C18)(天津博納艾杰爾科技公司)。

IgG標準蛋白、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、氯乙酰氨(CAA)、三氟乙酸(TFA)、肽-N-糖苷(PNGase F)、尿素(UA)(美國Sigma公司)；胰蛋白酶(Trypsin,測序級)(美國Promega公司)；乙腈(ACN)(美國Merck公司)；2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB)(美國Bruker公司)；Milli-Q去離子水制備系統(美國Millipore公司)；其它化學品均為分析純。

1.2 HepG2細胞培養與蛋白提取

HepG2細胞采用含有10%胎牛血清的高糖培養基(DMEM)在37 ℃、5% CO2環境下培養，待其生長至直徑10 cm表面皿的80%時，胰蛋白酶消化回收細胞。然后，使用1×PBS對獲得細胞進行3次洗滌去除培養基，再加入1 mL 8 mol/L UA溶解在0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.5)中重懸細胞,然后將其置于超聲波細胞粉碎機中進行細胞蛋白提?。撼暪β?00 W，工作1 s，間隙2 s，共99個循環。提取的蛋白應用Bradford法測定濃度，最后按照所需的量分裝，置于-80 ℃凍存備用。

1.3 人尿蛋白的獲取

尿液樣本來自健康男性和女性各3例(年齡25～30歲)，均為空腹晨尿的中段尿，收集至離心管中，于4 ℃下12 000 g離心15 min。取上清液與預冷丙酮混合，于-20 ℃下過夜。將預冷過夜的混合物取出，在4 ℃下2 000 g離心5 min獲得蛋白沉淀，加入8 mol/L UA緩沖液復溶蛋白。蛋白用Bradford法測定濃度，最后按照所需的量分裝，置于-80 ℃凍存備用。

圖1 GPAT樣品處理裝置和流程Fig.1 GPAT sample processing unit and proceduresreaction chamber A:digestion of proteins,release of N-glycans;reaction chamber B:enrichment of N-glycans

1.4 GPAT的設計及操作

如圖1所示，整個裝置由反應室A和反應室B組成，其制作成本低，制作時間短，在2～3 min內即可制作完成整個裝置。反應室A：在100 μL Tip尖端填一層篩板后引入C18填料，再在填料上方加一層篩板,依次使用純乙腈、50%ACN+0.1%TFA、0.1%TFA對其活化。反應室A主要用于蛋白的還原、烷基化、酶解、切糖以及N-糖鏈的分離。反應室B：在200 μL Tip尖端加載一層篩板，然后將HILIC填料引入Tip中,依次使用1%TFA、80%ACN+1%TFA對其活化。反應室B主要用于N-糖鏈的富集。兩個反應室活化過程中均使用Multi Spin除去液體。

GPAT操作流程：取10 μg 溶解于8 mol/L UA的蛋白加入到活化好的反應室A中，同時加入由100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶解的TCEP和CAA，終濃度分別為10 mmol/L和15 mmol/L,將其放入37 ℃恒溫箱中反應1 h。待反應完成后，加入適量100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)使反應體系中尿素濃度低于2 mol/L,然后按蛋白∶酶=50 μg∶1 μg比例加入Trypsin酶，放入37 ℃恒溫箱中消化16 h。反應完成后，按蛋白∶酶=20 μg∶1 U的比例加入PNGase F酶并在 37 ℃恒溫箱中切糖2 h。反應完成后，加入TFA使體系終濃度為0.1%,離心收集酶切液。加入和酶切液等體積的0.1%TFA，2 000 g離心1 min，將N-糖鏈組分洗脫至反應室B中，加入ACN和TFA使反應室B體系變為80%ACN+1%TFA,2 000 g離心 90 s使N-糖鏈與HILIC結合，加入80%ACN+1%TFA洗脫非糖鏈物質。最后，加入0.1%TFA洗脫N-糖鏈，收集組分待測。

1.5 FASP樣本制備流程

1.5.2 N-糖鏈的富集用EP管稱取5 mg的HILIC填料，先用0.1%TFA活化填料3次，每次10 min；再用80%ACN+0.2%TFA溶液平衡填料3次，每次10 min。將熱干的含有N-糖鏈的樣品復溶于80%ACN+0.2%TFA溶液，并與填料混合，于室溫下旋轉結合2 h。然后轉入到自制富集小柱，3 000 g離心1 min。用80%ACN+0.2%TFA溶液再洗1次去除非特異性結合的雜質，最后用0.1%TFA洗脫3次，得到純化的N-糖鏈。參照2018年Zhang等[12]使用的酸法去除N-糖鏈的唾液酸。

1.6 MALDI-TOF MS分析

采用對MALDI-TOF MS對N-糖鏈樣品進行分析。使用肽校準品(Bruker)進行外部校準，選擇2,5-DHB作為基質(用70%ACN+0.1%TFA溶解的1 mmol/L NaCl溶解配制，終濃度為20 mg/mL)，使用水溶解N-糖鏈樣本，取1 μL樣品點于潔凈的不銹鋼靶上，待自然干燥后取1 μL基質點靶，待樣品與基質自然結晶后推入離子源待測。所有樣品的激光強度保持恒定，累加1 500張譜圖，采用正離子反射模式對N-糖鏈進行分析。MALDI-TOF MS數據采用FlexAnalysis 3.3軟件進行分析，糖型采用GlycoWorkbench 2.0軟件進行分析。

2 結果與討論

2.1 IgG N-糖組分析

圖2 10 μg IgG采用GPAT獲得的N-糖鏈的MALDI-TOF MS譜圖Fig.2 10 μg IgG N-glycan MALDI-TOF MS spectra obtained with GPAT the glycoforms corresponding to each molecular weight are labeled;the N-glycan structure simple map display method uses the Consortium for Fuctional Glyomics(CFG) standard to display the graphical rules;the symbols represent the following meanings:“”D-galactose；“”D-mannose；“”N-acetyl-D-glucosamine；“”L-fucose.

在基于質譜的N-糖組分析中，通用的FASP樣品制備方案對于蛋白起始量要求很高，而N-糖鏈釋放前蛋白復雜的處理步驟,以及N-糖鏈富集前對N-糖鏈的熱干、重溶處理，不僅時間長且會造成樣品的損失和污染。本研究致力于降低樣品制備的蛋白起始量，減少樣品制備時間，以滿足基于質譜的快速、微量蛋白的N-糖組分析。還原劑TCEP和烷基化劑CAA相容，可以同時使用。因此，選用TCEP和CAA同時加入反應體系中對蛋白進行還原和烷基化處理，以達到簡化操作步驟、縮短操作時間的目的。由于GPAT是在離心機上進行，因此可以實現樣品的高通量分析。而對于N-糖鏈的富集,本研究在實驗室前期研究結果[13]的基礎上進行了優化，使N-糖鏈洗脫和富集可以實現無縫銜接，減少了常規的N-糖鏈富集時間和操作步驟，降低了N-糖鏈的損失。

圖3 10 μg HepG2細胞提取蛋白采用GPAT方法制備N-糖鏈得到的MALDI-TOF MS譜圖Fig.3 MALDI-TOF MS spectra of N-glycans prepared by GPAT protocol for 10 μg HepG2 cell extracts R1,R2,and R3 are three replicate experiments,and the glycoforms corresponding to each molecular weight are labeled

IgG是分子量約為150 kDa的糖蛋白，分子為Y型，由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，其中重鏈分為抗原結合區(Fab)和抗體結合區(Fc)。Fc段具有一個N-糖基化修飾位點(含量約為3%～4%)，該位點的N-糖鏈修飾比較保守，因此，使用IgG驗證GPAT對于單純蛋白N-糖鏈制備的可行性。由于唾液酸易帶負電，因此在質譜檢測時會抑制N-糖鏈的信號甚至導致N-糖鏈無法檢出，所以本實驗對所有N-糖鏈進行了酸法去除唾液酸。采用GPAT和FASP方法對分別對IgG進行N-糖組分析。采用GPAT分別對2、5、10、15、20 μg的 IgG進行N-糖組分析，同時采用FASP方法分別對10、15、20、50、100 μg的IgG進行N-糖組分析，得到兩種方法的IgG蛋白起始量分別為10、50 μg。如圖2所示，采用GPAT對10 μg IgG進行N-糖組分析，獲得了20種N-糖鏈,這與用FASP方法以50 μg IgG為起始量得到的結果一致。由此，在得到相同N-糖組分析結果的基礎上，GPAT方法所需要的蛋白起始量更低。

2.2 HepG2細胞提取蛋白的N-糖組分析

N-糖基化修飾在細胞、組織、分泌體系等蛋白中具有重要的功能性作用，因此研究這些蛋白樣本的N-糖組分布具有重要的意義。細胞、組織等樣本含有多種蛋白，蛋白成分復雜，這些復雜蛋白成分中也含有豐富的N-糖鏈信息。本研究以8mol/L UA提取人肝癌HepG2細胞系蛋白，并采用GPAT對其進行N-糖組分析。首先，根據“2.1”的實驗結果，采用10 μg HepG2細胞提取蛋白進行N-糖鏈的制備,并進行3次重復實驗。如圖3所示，3次實驗均鑒定到39種N-糖鏈。對3次重復實驗結果兩兩進行相關性分析，結果如圖4所示，其相關系數r2=0.953～0.976，說明方法具有很好的重復性。同時以2、5 μg蛋白為起始量采用GPAT方案制備N-糖鏈，MALDI-TOF MS分析結果均未得到N-糖鏈信號。

2.3 健康人尿蛋白N-糖組分析

尿液易于獲取，并且可以反映腎臟濾過蛋白質的功能，因此，尿液是公認的疾病診斷、監測和預后評價樣本理想來源[13-14]。尿液中可作為疾病診斷標志物的多為微量蛋白，例如，健康人尿中微量白蛋白最低含量為20 μg/mL，因此,常用的FASP方法需要基于大量的尿液樣本來獲取尿蛋白N-糖鏈信息。本研究采用GPAT方法，對從6例健康人(3例男性，3例女性)的500 μL尿液里提取的10 μg蛋白進行N-糖鏈制備。MALDI-TOF MS分析結果如圖5所示，在去除唾液酸異質性的基礎上，男性和女性尿蛋白均鑒定到了49種N-糖鏈且結構類型一致。如圖6所示，對3例男性和3例女性尿液樣本的實驗結果進行皮爾森相關性分析，組內分析結果為女性r2=0.938～0.958,男性r2=0.948～0.964，說明組內3次生物學重復有很好的重現性。男性和女性組間皮爾森相關性分析結果的平均r2=0.924。組間相關性小于組內相關性，說明N-糖鏈的相對豐度在男性和女性之間存在差異。對男性和女性尿蛋白N-糖鏈進行定量分析，其結果如表1所示。男性和女性尿蛋白N-糖鏈中存在2種差異糖型，分別為HexNAc(3)Hex(3)和HexNAc(7)Hex(9)(P<0.01)。本實驗樣品例數較少，進一步加大樣品例數后，將有望發現生理病理過程中相關的差異表達糖鏈信息。

圖6 3例男性和3例女性尿蛋白N-糖組分析結果進行皮爾森相關性分析Fig.6 The results of 3 males and 3 females were analyzed by pearson correlation analysis F1,F2 and F3 represent 3 different healthy females,and M1,M2 and M3 represent 3 different healthy males(F1、F2、F3代表3例不同的健康女性，M1、M2、M3代表3例不同的健康男性)

3 結 論

通過GPAT技術對10 μg IgG和10 μg HepG 2細胞提取蛋白進行N-糖組分析，分別鑒定到20種和39種N-糖鏈，證明了GPAT適用于微量蛋白N-糖組分析。將GPAT技術應用于健康人尿蛋白N-糖組分析，鑒定到49種N-糖鏈。同時對男性和女性鑒定到的各N-糖鏈進行差異分析，結果顯示HexNAc(3)Hex(3)和HexNAc(7)Hex(9)為差異顯著糖型。GPAT技術可以很好地應用于微量蛋白的N-糖組分析，具有操作步驟更少、操作時間更短、樣本制備起始蛋白量更低，可以實現樣品高通量分析的優點。但GPAT在分析含有唾液酸的N-糖鏈，適用于各種蛋白溶劑方面依然存在不足，在后續的研究中將進行改善。

表1 尿蛋白N-糖鏈MALDI-TOF MS相對定量結果Table 1 Relative quantitative results of urinary protein N-glycans by MALDI-TOF MS

Hex(己糖)；HexNAc( N-乙酰己糖胺)；Fuc(L-巖藻糖)