液液萃取/液相色譜-串聯質譜法分析海水中的短裸甲藻毒素

嚴忠雍，曾軍杰，龍 舉，方 益，陳 思*

(1.浙江省海洋水產研究所，浙江 舟山 316021;2.浙江省海洋漁業資源可持續利用技術研究重點實驗室，浙江 舟山 316021)

短裸甲藻毒素(Brevetoxin，BTX)是由反式聚合醚環構成的親脂性藻類毒素，也稱神經性貝類毒素，主要由短裸甲藻及裸甲藻屬部分藻類產生的赤潮藻毒素[1-3]。短裸甲藻毒素不僅污染海洋水體環境，還會造成海洋魚類死亡，從而帶來嚴重的海洋經濟損失[4-5]。此外，短裸甲藻毒素亦能霧化在波浪形成的氣溶膠中，人接觸或吸入后會刺激皮膚，甚至引起膜炎、鼻漏、支氣管收縮等呼吸系統癥狀[6-11]。目前，國內外尚未有海水中短裸甲藻毒素的限量標準及相關規定。美國通過監控短裸甲藻的細胞密度以預防短裸甲藻毒素的大規模爆發入侵：即每升海水中短裸甲藻的細胞數量≥5 000個時，禁止在受污染的相關海域捕撈貝類[12]。海水中短裸甲藻毒素限量標準的缺乏以及以藻細胞密度衡量污染狀況的規定，導致現有文獻多以短裸甲藻細胞密度為分析點，間接評價海水中短裸甲藻毒素的安全風險水平[13]。

海水分析通常采用固相萃取和液液萃取提取凈化目標物，但考慮到固相萃取成本較高，故本研究基于液相色譜-串聯質譜檢測技術，結合海水的基質特征，選擇液液萃取作為前處理方法。通過篩選合適的提取試劑，對提取體積、旋渦時間、提取次數、鹽析劑等參數進行單因素實驗分析；并在單因素實驗的基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法，確定海水中短裸甲藻毒素的最佳提取條件；最后通過回收率、精密度、定量下限等指標進行方法學驗證，建立了適用于海水中短裸甲藻毒素的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTMI-Class超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S質譜儀(美國Waters公司)；Avanti JXN-30高速離心機(美國Beckman Coulter公司);MS3 Control旋渦混勻器(德國IKA公司);VSD150氮吹儀(無錫沃信儀器制造有限公司)；FG2-B便攜式 pH計(瑞士Mettler Toledo公司)；AZ8371便攜式鹽度計(臺灣衡欣儀器儀表有限公司)。

BTX-1、BTX-2、BTX-3短裸甲藻毒素標準品均為100 μg(臺灣Algalchem公司)；乙酸銨、甲酸(色譜純，美國Sigma公司)；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、三氯甲烷(色譜純，德國Merck公司)；氯化鈉、氨水、乙酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；實驗用水均為經Millipore系統處理的超純水。

1.2 響應面實驗樣品前處理

移取經0.45 μm玻璃微纖維濾紙過濾的20 mL海水至50 mL離心管，加入100 μL 100 ng/mL的BTX混合標準工作液、鹽析劑和提取試劑后，旋渦混合，6 000 r/min離心5 min，將有機層轉移至15 mL離心管中，再復提取，合并上清液后于40 ℃水浴條件下氮氣吹干；加入1 mL乙腈，旋渦混合60 s，經0.22 μm有機微孔濾膜過濾后，供LC-MS/MS分析。

1.3 樣品前處理方法

移取20 mL經0.45 μm玻璃微纖維濾紙過濾的海水樣品至50 mL離心管中，加入6 g氯化鈉旋渦混合90 s，再加入5 mL乙酸乙酯，旋渦振蕩60 s后，6 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至15 mL離心管中；加入5 mL乙酸乙酯再提取1次，合并上清液后于40 ℃水浴條件下氮氣吹干；加入1 mL乙腈，旋渦混合60 s，經0.22 μm有機微孔濾膜過濾后，供LC-MS/MS分析。

1.4 色譜-質譜條件

色譜柱：ACQUITYTMUPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；進樣體積5 μL；樣品室溫度10 ℃；柱溫35 ℃；流速0.2 mL/min；流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫：0～1.0 min，50% A；1.0～2.0 min，50%～65%A；2.0～9.0 min，65% A；9.0～9.5 min，65%～50%A；9.5～11 min，50% A。

電噴霧離子源，正離子掃描；檢測方式：多反應監測模式；毛細管電壓：2.5 kV；離子源溫度：130 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；錐孔氣流量：200 L/h；脫溶劑氣流量：800 L/h；短裸甲藻毒素的質譜參數見表1。

表1 3種短裸甲藻毒素的質譜參數Table 1 MS parameters of three BTXs

*quantitative ion

1.5 數據處理

采用SPSS 19軟件對實驗數據進行分析處理；采用Design expert 8.0響應面軟件進行模型方程擬合和多元回歸分析。

2 結果與討論

2.1 海水體積的確定

Pierce等[14]對海水中短裸甲藻毒素的含量(BTX-1、BTX-2、BTX-3的總和)與短裸甲藻的細胞密度之間的相關性進行研究，發現單個藻細胞的毒力水平為14～323 pg，5 000個細胞的毒力水平為70～1 615 ng，即常規海水中的短裸甲藻毒素含量應小于0.07 μg/L。結合儀器靈敏度，計算得到海水定量分析所需的體積約為15 mL；考慮到方法前處理的損失和實驗數據的偏差，將海水體積確定為20 mL。相較于傳統的細胞計數法[12]，這不僅減少了海水分析所需體積，降低了耗材試劑量；同時也能滿足海水定量分析的需要，從而有效評估短裸甲藻毒素的安全風險水平。

2.2 提取試劑對萃取的影響

短裸甲藻毒素屬脂溶性聚醚類藻毒素，且樣品基質是海水，應優先考慮能與水分層的有機試劑，以便于分離移取提取試劑，縮短前處理時間，提高實驗效率。因此，實驗分別選擇乙酸乙酯、三氯甲烷、正己烷3種常用色譜提取有機溶劑，比較其對海水中BTX萃取效率的影響。結果顯示，正己烷的萃取效率最低(48%～62%)，三氯甲烷的萃取效率為71%～75%，但其易氧化，屬2B類致癌物，且離心后在水層之下不易移??；而乙酸乙酯的萃取效率為74%～79%，低毒且易移取，便于操作。故本實驗選擇乙酸乙酯為最佳提取試劑。

2.3 提取體積對萃取的影響

乙酸乙酯微溶于水，過低的提取體積會導致無法收集有效有機層；而過高的提取體積則加大了試劑量，延長了濃縮時間，降低了實驗效率。結合液液萃取少量多次的原則，本實驗選擇3、4、5、6 mL乙酸乙酯提取兩次。結果顯示(以3種BTX總量計)，3 mL的乙酸乙酯由于第一次提取時體積較少，部分乙酸乙酯溶至水中，導致萃取率較低(為78%)；4、5、6 mL乙酸乙酯的萃取率分別為88%、90%、91%，3種提取體積的萃取率差異不大。出于降低試劑量，縮短前處理時間的考慮,最終選擇用乙酸乙酯提取兩次，每次5 mL。

圖1 氯化鈉質量對3種短裸甲藻毒素萃取率的影響Fig.1 Effect of NaCl amount on extraction efficiencies of three BTXs

2.4 鹽析劑對萃取的影響

在萃取過程中，常加入溶于水相但不被萃取的無機鹽作為鹽析劑，以吸引一部分自由水分子，減少水溶液中自由水分子的量，降低被萃取物和提取溶液在水中的溶解度，從而提高萃取效率[15]。實驗選擇氯化鈉為鹽析劑，分別加入0、1、2、3、4、5、6、7 g(因7 g氯化鈉在20 mL海水中已飽和，故未再往上增加量)，考察了不同質量鹽析劑對短裸甲藻毒素萃取效率的影響。結果如圖1所示，當氯化鈉的質量為6 g時，萃取率達到最高；而其它質量對應的萃取率由于水合作用不充分或溶液體系失衡等原因未能達到最佳值，故選擇6 g氯化鈉為最佳鹽析劑的用量。

2.5 旋渦時間對萃取的影響

液液萃取通常需要萃取劑與被萃取溶劑長時間混勻振蕩，從而充分提取被萃取溶劑中的目標化合物。由于海水體積較少，無需采用分液漏斗，故使用50 mL離心管即可，并選擇色譜前處理常用的旋渦混勻器充分提取海水中的短裸甲藻毒素。實驗分別旋渦混合30、60、90、120 s，考察了不同旋渦時間對3種短裸甲藻毒素萃取效率的影響。結果顯示，3種短裸甲藻毒素在30 s旋渦時間時的萃取效率較低，而在60、90、120 s時的萃取效率相近；考慮到90 s和120 s的旋渦時間相對較長，延長了前處理時間、降低了實驗效率，最終選擇最佳旋渦時間為60 s。

表2 海水中BTX萃取條件優化實驗的因素水平表Table 2 Factors and level for optimizing the extraction conditions of BTX in seawater

表3 響應面分析方案和實驗結果Table 3 Response surface analysis scheme and experimental results

2.6 響應面優化實驗

經過上述單因素數據分析，可知海水中短裸甲藻毒素的最佳萃取條件為：以乙酸乙酯提取2次，每次5 mL，加6 g氯化鈉作為鹽析劑，每次萃取旋渦時間為60 s。為達到更好的萃取效率，精準量化多因素的影響水平，根據中心組合實驗設計原理，選取提取體積(A)、氯化鈉質量(B)、旋渦時間(C)為考察變量，以3種 短裸甲藻毒素(以3種BTX總量計)的萃取效率為響應值，設計三因素三水平的響應面分析方法。每個變量因素的低、中、高試驗水平分別以-1、0、1進行編碼，試驗因素與水平設計見表2。采用Design expert.8.0響應面軟件對數據進行分析，結果見表3。序號3、6、10、11和13為中心試驗，其它序號為析因試驗，16個試驗點分為零點和析因點，零點為中心點，試驗重復4次，用以評估誤差。得到二次多項回歸模型方程為：萃取率=99.82+1.34A+0.76B+2.25C+0.32A×B+0.90A×C+0.20B×C-1.92A2-2.72B2-1.90C2。

中心組合設計回歸分析結果如表4所示，該模型F值為7.87，P值為0.006 3(小于0.05)，具有顯著性；失擬項F值為0.31，P值為0.820 7(大于0.05)，不具顯著性，表明該模型能與實驗良好擬合，實驗誤差較小。決定系數(R2)為0.910 0，反應預測值和實驗測定值具有良好的相關性，表明該模型能代表實驗結果，可對海水中BTX含量進行分析和預測。由模型計算可知，在單因素條件下A、C對萃取率有顯著性影響(P小于0.05)，B對其影響不顯著，A2、B2、C2對萃取率的影響顯著。通過比較A、B、C的F值可知，旋渦時間對萃取率的影響最大，其次是提取體積，而氯化鈉質量的影響最小。

表4 回歸分析結果Table 4 Regression analysis results

圖2 響應曲面圖Fig.2 Response surface plots of extractionⅠ.amount of NaCl and extraction solvent volume；Ⅱ.Vortex time and extraction solvent volume；Ⅲ.Vortex time and amount of NaCl

對A、B、C 3個因素進行兩兩交互作用分析，以任意兩個因素為研究因子，萃取率為因變量，繪制響應曲面圖，見圖2(Ⅰ～Ⅲ)。3張響應面分析圖均呈山丘形曲面，存在極大值，經響應面模擬分析可得最佳萃取條件為：提取體積5.07 mL，氯化鈉質量6.07 g，旋渦時間60.72 s；但考慮到實際操作和實驗效率，將萃取條件調整如下：提取體積5 mL，氯化鈉質量6 g，旋渦時間60 s。為進一步驗證響應面法的可靠性，采用上述條件對海水中3種短裸甲藻毒素進行萃取，實際測定的萃取率與理論預測值相比，相對誤差為1.6%。表明響應面法能有效反映各因素對萃取率的影響程度，并精確預測趨勢理論值，因此采用響應面法優化得到的海水中短裸甲藻毒素萃取率的參數穩定可靠，具有實際使用價值。

2.7 方法學評價

分別移取100 μg/L BTX混合標準工作液0.01、0.05、0.1、0.2 mL，1 mg/L BTX混合標準中間液0.05、0.2 mL，配制質量濃度分別為1、5、10、20、50、200 μg/L的系列標準工作溶液，以BTX的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作標準曲線。結果顯示，3種BTX在1～200 μg/L質量濃度范圍內均具有良好的線性關系，相關系數均大于0.996。根據20 mL的海水體積，結合3倍和10倍信噪比，得到本方法中3種BTX的檢出限均為0.02 μg/L，定量下限均為0.05 μg/L。

采用陰性海水加標回收實驗考察本方法的準確度和精密度，即在20 mL陰性海水樣品中添加3種BTX混合標準工作液，使其加標濃度分別為0.1、0.3、1.0 μg/L，每個濃度水平重復6次，連續測定3天，依次計算回收率、日內相對標準偏差(RSD)及日間相對標準偏差，結果見表5。在0.1、0.3、1.0 μg/L 3個加標濃度水平下，3種BTX的回收率為95.4%～104%，日內相對標準偏差為2.2%～5.3%，日間相對標準偏差為3.0%～4.5%，表明方法具有良好的準確度和精密度。

表5 海水中BTX的平均回收率及相對標準偏差Table 5 Average recoveries and RSDs for BTX in seawater

2.8 實際樣品的分析

應用基于液液萃取的液相色譜-串聯質譜分析方法，對浙江省沿岸共計20 份海水樣品進行前處理與檢測。以本方法檢出限(0.02 μg/L)為依據，判定檢測樣品是否含有短裸甲藻毒素。結果顯示，樣品均未檢出BTX，表明常規海水是相對安全的，未受短裸甲藻毒素污染。本研究通過實驗室培養短裸甲藻(Kareniabrevis)的方式，測定其培養海水中3種短裸甲藻毒素的含量，進一步驗證本方法的時效性。結果顯示，海水中未檢出BTX-1，檢出BTX-2質量濃度為38 μg/L，BTX-3為56 μg/L；表明方法能有效測定海水中短裸甲藻毒素。

3 結 論

本方法基于液液萃取/液相色譜-串聯質譜法定量分析海水中3種短裸甲藻毒素。利用液相色譜-串聯質譜的高靈敏度，將海水分析體積減至20 mL,通過響應面優化確定了海水中短裸甲藻毒素的最佳提取條件。方法降低了樣品分析體積，提高了前處理效率，且時效性和適用性強，可實現污染海水中短裸甲藻毒素的高效率痕量分析。