甘蔗赤腐病菌變異及甘蔗抗病性研究進展

李婕，張榮躍，王曉燕，單紅麗，尹炯，羅志明，倉曉燕，黃應昆

（云南省農業科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南開遠 661699）

0 引言

甘蔗（Saccharum officinarumL.）是重要的糖料作物之一，而甘蔗赤腐病是甘蔗上最嚴重的真菌病害之一，主要危害蔗莖（即蔗莖赤腐?。┖腿~片中脈（即中脈赤腐?。?。嚴重危害時可導致甘蔗減產29.1%以及蔗糖分損失30.8%以上[1]，嚴重影響甘蔗產量和品質。甘蔗赤腐病在中國各蔗區均有發生，近年來，由于甘蔗連作、氣候多變、高濕多雨及多種病蟲害混合發生等因素，為甘蔗赤腐病的發生流行提供了有利條件，部分蔗區甘蔗赤腐病危害嚴重，已由次要病害上升為主要病害。目前生產上無高抗品種，加上藥劑防控效果不理想，甘蔗赤腐病菌變異頻繁，以及長期種植單一感病品種等原因，常造成抗病品種“喪失”抗性而成為感病品種。

甘蔗赤腐病病原菌無性階段為刺盤孢屬的鐮孢炭疽菌（Colletotrichum falcatumWent）[2]，該菌分生孢子的致死溫度較高（60℃、10 min）[3]，因此種苗溫水處理不能有效殺死蔗種中攜帶的赤腐病菌，不過，實踐證明，在甘蔗種植之前選用合適的藥劑對種莖進行消毒，是減少該病發生的有效途徑之一[4]。然而明確該病的發病及抗性機理，對病原菌變異及品種抗病性進行深入研究才是病害可持續防控的必由之路，因此本文結合國內外最新研究進展，對甘蔗赤腐病菌變異、分子檢測方法及甘蔗抗赤腐病研究進行了綜述，以期為我國甘蔗赤腐病的研究和防控提供重要理論依據。

1 甘蔗赤腐病菌變異

甘蔗赤腐病菌極易發生變異，目前在形態變異、致病性變異及分子變異方面已有大量研究。研究推斷多數菌株形態分類與致病性變異呈正相關，而分子多樣性無此關聯性[5]。

1.1 形態變異

甘蔗赤腐病存在形態變異，早期研究工作者根據培養菌落顏色、菌絲形態和孢子形成將赤腐病菌分為了淺色小種和深色小種（light type和dark type）[5-7]，而淺色小種產生豐富的分生孢子，毒性也比深色小種要強[6]。Malathi 等通過對親本品種進行致病性差異研究，發現雖然各菌株能夠侵染所有的參試品種，但是熱帶致病型比亞熱帶致病型毒力更強，認為分生孢子盤萌生、孢子形成與致病型毒力相關[8]。

1.2 致病性變異

雖然菌株在培養性狀及形態特征上表現出變異，但是僅用這些性狀進行變異分類并不可靠，因此，基于不同寄主進行致病性測定被用來進行變異研究。甘蔗赤腐病菌致病力的差異主要表現在同一菌株對不同寄主的致病力差異或不同菌株對同一寄主的致病力差異。

上個世紀初美國首次報道了甘蔗赤腐病菌致病性變異[9]，隨后國外許多研究者對該病害病原菌致病性變異進行了大量研究，特別在印度研究較為全面。Sangdit 等根據致病性將泰國甘蔗赤腐病菌分為兩個小種（致病的和不致病的）[10]。而印度甘蔗赤腐病菌有11 種致病型（CF01～CF11），其中亞熱帶地區有7 種而熱帶地區有4 種[11-12]。早期，Beniwal 等鑒定了亞熱帶地區品種Co 1148、Co 7717 和CoJ 64 上的3 種致病型，分別為CF 01、CF 02、CF 03[13]。隨后Padmanaban 等從品種Co 419、Co 997 和CoC 671 分離到3 種致病型，分別為Cf 419、Cf 997 和Cf 671，后被命名為CF04、CF05、CF06[14]。20 世紀80 年代，從熱帶地區品種Co 419、Co 658、Co 997、Co 6304 上分離的致病菌株被用于甘蔗抗赤腐病品種篩選[15]。然而，Viswanathan 等研究表明，與之前所用的致病型相比，分離自品種CoC 671、CoC 85061、CoC 86062 和CoC 92061 的菌株表現出更強的致病力[16]，致病型Cf 671和Cf 92061具有很強的侵染力并給泰米爾納德邦、安得拉邦的許多地區及古吉拉特邦、卡納塔克邦的部分地區甘蔗造成巨大損失[17]，雖然新致病型如Cf 92061、Cf 90063 和Cf 767 毒性比Cf 671 強[18]，但是它們不能長期維持其毒性，并在幾年后毒性減弱[12]，而新致病型Cf 671 能維持其毒性多年，因此20 多年來印度用Cf 671進行抗赤腐病篩選[15]。然而，2004年，Viswanathan從品種Co 94012分離到新致病型Cf 94012，并用32個甘蔗品種對致病型Cf 671和新致病型Cf 94012進行了連續7年的致病力試驗觀測，結果顯示新致病型Cf 94012 比致病型Cf 671 毒性更強[15]。同樣，Prittesh 等分離的cf CHA 菌株毒性較強，可侵染7個甘蔗品種，并篩選到高抗甘蔗品種Co 94004。國外一系列的致病性研究結果表明，甘蔗赤腐病菌致病性變異頻繁，常造成許多抗病品種喪失抗性而成為感病品種[19]。病原菌致病性研究是抗病資源挖掘和篩選的基礎與關鍵，而我國甘蔗赤腐病致病型及其變異情況目前尚未明確，急需開展相關研究工作。

1.3 分子變異

隨著分子技術的快速發展，PCR分子標記技術被廣泛應用于分子變異研究，為植物病原菌的遺傳差異鑒定提供了新的方法和手段，如RAPD、ISSR 等技術。Madan 等用RAPD 分子標記技術，用6 對引物對分離自哈里亞納邦的5 個菌株進行了多樣性研究，多態性只有23%，UPGMA 聚類分析將所有菌株分為了2 個類群[20]。Mohan 等用61 對RAPD 引物對赤腐病菌進行擴增，多態性為76%[21]。Suman 等用40 對RAPD 標記對6個標準菌株進行擴增，多態性為78.6%，遺傳差異超過50%，UPGMA 聚類分析將所有菌株分為兩個類群[22]。Malathi 等用ITS 將印度熱帶和亞熱帶的9 個致病型分為兩個類群[8]。Kumar 等對分離自印度亞熱帶地區的甘蔗赤腐病菌進行了種群遺傳結構研究，用RAPD、URP和ISSR分子標記將25個菌株劃分為6 個類群，遺傳相似性為34%，表明這些菌株遺傳多樣性豐富[23]。

2 甘蔗赤腐病快速分子檢測技術

目前已開發出甘蔗赤腐病快速分子檢測技術，Nithya等用RAPD 引物OPE-01 從赤腐病菌基因組擴增出560 bp 片段，并基于此序列設計了一對SCAR標記引物，通過特異性驗證，SCAR-F/R引物只對甘蔗赤腐病菌有很高的特異性，而對其他炭疽菌沒有特異性，引物為SCAR-F 5′-CCTACCCAACCGAGTATCG-3′和SCAR-R 5′-GCGCAGCTTGCTCTCAAGAGC-3′，擴增產物為442 bp[24]。吳偉懷等建立了甘蔗黑穗病和赤腐病雙重PCR 檢測體系，甘蔗黑穗病引物為CLS 320F/R，甘蔗赤腐病菌的引物為SCAR-F/R[24-26]。Chandra等通過設計兩對外引物及兩對內引物，篩選出3組LAMP特異性引物（RRSC1、RRSC4、RRSC5），建立了一種利用環介導等溫擴增技術（LAMP）檢測甘蔗赤腐病菌的方法，并對LAMP 反應體系進行了特異性和靈敏性檢測，其靈敏度比普通PCR（SCAR-F/R引物）檢測技術要高5～10倍，實現了該菌檢測的可視化[27]。

3 甘蔗抗赤腐病研究

目前，甘蔗抗赤腐病研究主要集中在甘蔗品種抗病性研究、抗病分子標記及誘導抗病性幾個方面。

3.1 甘蔗品種抗病性研究

甘蔗品種寄主抗性、蔗糖含量與病原菌毒力具有相關性。Malathi等用6 個甘蔗品種的12 個基因型研究了赤腐病菌變異與寄主抗性的關系，培養研究表明赤腐病菌毒力相關因素（生長、孢子形成和分生孢子萌發）與寄主抗性呈負相關，與不同甘蔗品種蔗汁蔗糖含量呈正相關；致病性研究表明，通過赤腐病菌致病型鑒別不同品種寄主抗性要有選擇性，尤其是毒力較弱的菌株對蔗糖含量低的甘蔗品種侵染效果好，因此為了有效篩選，不同品種基因型的選擇取決于致病型毒力，必需選擇侵染好的優勢菌株[28]。

作物受到病原體侵染、紫外輻射、低溫等不良刺激后會合成各種次生代謝產物、病程相關蛋白等進行防御。早期Viswanathan 等報道了抗赤腐病甘蔗品種中植保素合成比感病品種多[29]。Malathi 等進行了更進一步的研究，利用高效液相色譜儀分析了抗病甘蔗品種（Co 93009）和感病甘蔗品種（COC 671）接種赤腐病菌后植保素的合成情況，結果顯示抗病品種在接種赤腐病菌后合成了兩種植保素木樨黃定（Luteolinidin）和芹菜定（Apigeninidin），接種24 h 后在感抗品種中都檢測到木樨黃定（Luteolinidin），但是48～72 h 后在抗病品種中增加而在感病品種中不變，在接種赤腐病菌48～72 h 后只在抗病品種中檢測到芹菜定（Apigeninidin），并非常明確地證明了抗病品種在較高水平上特異性誘導了3-脫氧花色素（3-deoxyanthocyanidins），此外還發現在抗病品種中這種誘導當時是快速的[30]。Viswanathan等研究表明，在接種赤腐病菌后抗病品種Co 93009較早地積累了幾丁質酶（Chitinase）和類甜蛋白（Thaumatin-like protein）等病程相關（PR）蛋白，而感病品種（CoC 671）此類誘導顯著延遲[31]。

3.2 抗病分子標記

開發抗病分子標記技術，可加快抗病育種進程。Alvi 等利用RAPD 分子技術研究了12 個抗赤腐病甘蔗品種和5個感病品種基因型的遺傳差異，感病和抗病甘蔗基因型間的平均遺傳相似性為74.37%，這表明大部分基因組是相似的，甘蔗基因型多態性程度與抗或感赤腐病無關聯[32]。Virupakshi 等用ISSR 標記分析了7個抗/中抗赤腐病和5 個感赤腐病甘蔗葉綠體和線粒體基因組，UPGMA 聚類分析將甘蔗品種分為抗/中抗和感病兩個聚類，該結果表明該標記是抗病品種鑒定、遺傳關系分析和多樣性評價的一個新的有力工具[33]。Jayashree等用抗病基因同源序列（RGA）策略，從抗性蛋白的保守結構域設計了29個RGA引物，對赤腐病抗性不同的40 個甘蔗品種進行遺傳多樣性分析，結果顯示品種間遺傳相似性范圍為58.4%～90%，平均遺傳相似性為74.2%，聚類分析將感病和抗病品種明顯地區分開，共鑒定出14 對引物擴增出的25 個特異片段與抗性相關，8對引物擴增出的8 個特異片段與感病性相關，這些被發現與品種抗/感赤腐病相關聯的抗病基因同源序列是一種有價值的標記來源，可在育種中用于篩選抗赤腐病材料[34]。同樣，Sharma 等用抗病基因同源序列策略鑒定了18 個片段與抗赤腐病關聯，可作為抗病特異性標記，7 個片段與感赤腐病關聯，可作為感病特異性標記[35]。Singh 等利用SSR 標記對赤腐病抗性不同的30 個甘蔗基因型進行了遺傳多樣性研究，聚類分析清楚地區分了所有的基因型，抗病基因型（ISH150和SES594）明顯地處于一個聚類，而其余的基因型分成兩個明顯的聚類，將中抗和易感甘蔗基因型分開[36]。Singh 等發現SSR 標記中UGSM316850和UGSM31660與中抗品種緊密關聯，而UGSM316400與高感品種密切關聯[37]。

3.3 誘導抗病性研究

誘導抗病性主要是通過外來因子對植物的刺激來激活和調控植物自身免疫反應以抵御外來病原菌侵染。目前研究較為深入的有系統獲得抗性(system acquired resistance,SAR)和誘導系統抗性(Induced system resistance,ISR)。

植物誘導抗病劑苯并噻二唑[Acibenzolar-S-methyl，benzo（1，2，3-thiadiazole-7-carbothioic acid-S-methyl，BTH）]是一種人工合成的SA 類似物，BTH 本身不具有直接的抑菌作用，但能誘導植物產生抗性從而有效抵御病原菌的侵染。Sundar等分別用100μg/mL的苯并噻二唑（Acibenzolar-S-methyl）、水楊酸（Salicylic acid）、異煙酸（Isonicotinic acid）和丁二酸（Succinic acid）對高感赤腐病品種CoC 671 和CoC 92061系統獲得抗性誘導（SAR）進行對比研究，結果顯示所有誘導抗病劑處理后的甘蔗由高感變為中抗，其中苯并噻二唑誘導了較高水平組織抗性，有效限制了病原菌的定植，并伴隨著過氧化物酶（POX）和多酚氧化酶（PPO）的顯著提高，證明了氧化酶的誘導是系統獲得抗性的機制之一[38]。同樣Ashwin 等試驗結果也證明了誘導系統獲得抗性抵御甘蔗赤腐病的幾個誘導抗病劑中苯并噻二唑是最有效的[39]。

Viswanathan 等早期研究表明，熒光假單胞菌可誘導系統抗性（ISR），從而顯著減少赤腐病菌定植，減少糖分損失；隨后對不同抗性甘蔗品種進行了熒光假單胞菌誘導系統抗性研究，結果顯示高感品種誘導抗病性比中抗和中感品種更顯著，該結果表明對于抵御赤腐病，與甘蔗固有的寄主防御機制相比，誘導系統抗性不顯著；此外，熒光假單胞菌的使用還減少了轉化酶，提高了蔗汁質量[40-42]。

4 展望

4.1 甘蔗赤腐病防控

甘蔗赤腐病可對甘蔗造成巨大經濟損失，初侵染源為帶病蔗種和田間的病株殘葉，可隨風雨、露水傳播進行再侵染，有效防治難度較大。而長期以來甘蔗赤腐病是我國蔗區一種次要病害，對其研究較少，但近年蔗莖赤腐病局部發生嚴重，缺少準確的診斷與有效的防治技術，經濟損失較重[43]，現已上升為甘蔗主要病害。甘蔗赤腐病菌容易發生變異，新致病性小種的產生導致甘蔗品種抗病性“喪失”，即使種植抗病品種，在8～10年內該品種也會因新的更具致病性小種的出現而感病[44]，單一的防治方法并不能有效減輕甘蔗赤腐病造成的損失。應避免長期種植單一高感品種ROC 1、ROC 22、ROC 16、臺糖89-1626、粵糖93-159、粵糖00-236[2,45]；蔗種可用木霉菌（Tichodermaspp.）、假單胞菌（Pseudomonasspp.）、芽孢桿菌（Bacillusspp.）等生物防治劑進行蔗種及土壤處理進行防控[45]；蔗莖上的螟蟲蛀孔是赤腐病菌孢子主要的侵入通道[2]，應加強對螟蟲的監控，采用頻振式殺蟲燈或性誘劑誘殺成蟲，或釋放赤眼蜂等進行螟蟲防控[46]；同時應加強田間管理，減少殺菌劑的使用，結合多種綠色防治手段進行綜合綠色防控，有效控制病害大面積發生流行，減輕危害損失，實現甘蔗赤腐病的可持續控制[45]。

4.2 甘蔗赤腐病菌群體遺傳結構研究

與國外相比我國對該病害研究相對薄弱，目前主要集中在殺菌劑和生防菌室內篩選階段，缺乏深入系統的研究，甘蔗赤腐病病原菌群體遺傳結構及甘蔗品種抗性情況尚未明確，阻礙了抗病品種的利用及精準防控的實施。今后，科研工作者應積極開展甘蔗赤腐病不同地理環境病原菌群體的鑒定、系統進化及多樣性研究，掌握不同生態區甘蔗赤腐病主要致病菌類群，深入研究赤腐病菌致病機理、成災規律，這對開展相應的抗性研究及利用具有重要意義；并對赤腐病菌抗藥性進行實時監測，利用已開發的簡便、快速、高效且不需昂貴儀器及實驗條件的環介導等溫擴增技術（LAMP）進行檢測[47]，該方法有利于在基層推廣使用。

4.3 甘蔗赤腐病抗病基因挖掘

中國國家甘蔗種質資源圃保存有6 個屬16個種的2 800余份各類甘蔗種質資源材料，是中國乃至世界甘蔗遺傳改良的巨大珍貴基因庫，是抗病基因的重要來源，穩定多抗的甘蔗品種種質資源是進行赤腐病抗性育種的基礎和關鍵，在未來的研究工作中，利用分子標記育種技術提高育種效率，從巨大種植資源庫充分挖掘甘蔗品種抗病基因，篩選優良種質資源，全面解析甘蔗赤腐病的抗病遺傳規律和抗性機制，發掘和定位在不同環境中能穩定表達的主效QTL。