嗜肺軍團菌致病性與效應蛋白的研究進展

黃雨萱，鄭賢惠，朱翠明，李水紅

(南華大學衡陽醫學院病原生物學研究所，湖南 衡陽 421001)

軍團菌屬(Legionella)是一類需氧革蘭陰性桿菌，廣泛分布于天然淡水、人工供水系統(如沐浴器、噴水池、冷卻水塔)、空調制冷裝置、車輛的雨刷水箱及單細胞原生動物(如阿米巴變形蟲)細胞內[1]。目前，該屬已發現60多個菌種，約一半以上菌種可對人致病[2]，其中嗜肺軍團菌 (Legionellapneumophila)的致病力最強。免疫力低下的人群因吸入含嗜肺軍團菌的氣溶膠而引起人類軍團病(Legionella disease)，又稱退伍軍人癥。軍團病是一種可致命的急性發熱性呼吸道傳染病，由于首次暴發于1976年美國費城召開的一次退伍軍人大會期間而得名，此后陸續在全球出現多次小范圍的暴發流行[3-5]。根據患者的臨床表現，軍團病可分為龐蒂亞克熱 (Pontiac fever)和軍團菌肺炎(Legionella pneumonia)兩種類型。龐蒂亞克熱是一種非肺炎型軍團病，主要表現為急性流感綜合征，無明顯肺部病變，通常3～5 d即可自愈。軍團菌肺炎是一種以肺部病變(如化膿性支氣管炎、大葉性肺炎伴小膿腫形成)為主的急性全身性疾病，可由肺部遷徙入血引起播散，導致皮膚、肌肉、消化、神經等多系統損傷[6]。軍團菌肺炎發病迅速、病死率高，已引起醫學界的廣泛關注。

1 嗜肺軍團菌的胞內生存機制

嗜肺軍團菌可在營養較少的污水中存活數月甚至一年，且易與水中其他微生物相互作用形成混合菌生物被膜(biofilm)[7-9]。此時的嗜肺軍團菌生存能力較強，但對宿主細胞的感染能力則相對較弱，處于“活而不可養”(viable but non-culturable, VBNC)狀態[10-11]。自由生活阿米巴(FLA)能以細菌為食，被稱作微生物界的“特洛伊木馬”；而抗阿米巴菌能在FLA胞內存活與增殖，引起人類致病菌的擴散和傳播[12]。嗜肺軍團菌是一種典型的兼性胞內菌和抗阿米巴菌，能通過FLA (如棘阿米巴、福氏耐格里阿米巴)的吞噬而在其細胞中存活和增殖[13]。軍團菌除了可以在阿米巴等單細胞原始動物胞內寄生和增殖外，還可以侵染哺乳動物的肺泡上皮細胞 (epithelial cell)和單核巨噬細胞(macrophage cell)，并在其中增殖，最終導致宿主細胞死亡。

嗜肺軍團菌被阿米巴捕食后，迅速被封入由線粒體和細胞囊泡包繞的吞噬囊泡中，這個含有嗜肺軍團菌囊泡體的結構被稱作Legionella-containing vacuole(LCV)。嗜肺軍團菌分泌的效應蛋白(effector)可調控宿主胞內運輸途徑和內外環境。吞噬起始階段，LCV表面因帶有宿主線粒體核糖體成分始終不會被酸化，同時募集內質網囊泡輸送的蛋白并與之連接[14]。吞噬最后階段，LCV膜融入粗面內質網中被多層粗內質網膜所包圍，形成一種內體阻滯吞噬體(endosomal maturation-blocked, EMB)[15-16]。EMB的形成進一步抑制了LCV與溶酶體的融合，而避免被降解消化。

侵染早期，嗜肺軍團菌在效應蛋白的作用下，干擾宿主的細胞周期，抑制宿主細胞的凋亡，創造出理想的胞內增殖環境，幫助軍團菌從宿主細胞中逃逸與增殖[17-18]。侵染后期，隨著嗜肺軍團菌在EMB中不斷地消耗宿主營養物質并大量增殖，最終漲破吞噬泡。嗜肺軍團菌分泌的某些效應蛋白可誘導宿主細胞凋亡，使宿主細胞裂解死亡，從而從宿主胞內成功釋放[19]。

2 嗜肺軍團菌的致病物質

嗜肺軍團菌產生的酶類(肽基脯氨?；悩嬅?、磷酸酯酶、DNA酶、蛋白水解酶等)、毒素(內毒素、細胞毒素等)和溶血素可造成宿主細胞損傷。肽基脯氨?；悩嬅缚稍鰪娗秩揪奘杉毎哪芰20]；磷酸酯酶可抑制中性粒細胞超氧化物陰離子的產生，而后者可作為第二信使參與免疫應答等生理功能；細胞毒素可影響中性粒細胞的氧化代謝；脂多糖可促進嗜肺軍團菌對宿主細胞的黏附，并具有促炎作用，引起肺部感染[21-22]。軍團菌產生的這些致病物質還可對抗宿主的免疫殺傷，使其在吞噬囊泡中存活并增殖，最終導致宿主細胞死亡[23]。嗜肺軍團菌內毒素除引起高熱、低血壓、彌散性血管內凝血、內毒素休克等革蘭陰性內毒素相同生理病理反應外，還可通過激活補體系統，促進嗜肺軍團菌進入單核巨噬細胞胞內[24]。此外，菌毛的黏附作用，微莢膜的抗吞噬作用也參與其發病過程。

嗜肺軍團菌可以在宿主細胞內存活主要是依賴其獨特的毒力分泌系統向宿主胞內注入分泌型效應蛋白。嗜肺軍團菌具有I、II、IVA、IVB及V型分泌系統[25]，其中IVB型分泌系統 (type IVB secretion system, T4BSS) 在侵染宿主的過程中發揮了至關重要的作用[26-27]。T4BSS分泌系統又被稱作Dot/Icm分泌系統，主要由2個致病區域(共7個基因和18個Icm)組成。其中Dot 代表細胞器轉運缺陷基因(defective organelle trafficking gene)，Icm代表細胞內繁殖基因 (intracellular multiplication gene)。嗜肺軍團菌Dot/Icm IVB型分泌系統是其最主要的毒力系統，可向宿主細胞內注入300種以上的效應蛋白，而這些蛋白在其侵染宿主過程中發揮了重要生物學功能[28]。

3 嗜肺軍團菌效應蛋白的主要功能

嗜肺軍團菌的毒力因子除普通胞外菌具有的侵襲力和毒素外，還包括能影響其在宿主細胞內存活與增殖的所有菌蛋白[29]。嗜肺軍團菌非效應蛋白的毒力蛋白包括：Fe2+轉運蛋白FeoB[30]、鞭毛調控σ因子FliA[31]、磷脂酶A調控σ因子RpoS[32]、肽基脯氨?；樂串悩嬅窶ip[33]、毒素RtxA[34]、促內吞蛋白EnhC[35]和熱休克蛋白HSP60[36]等。Dot/Icm分泌系統效應蛋白作為主要的效應蛋白，由于其在致病過程中發揮重要作用，近年來相關研究逐漸增多。這些效應蛋白參與軍團菌感染、復制、增殖和自噬的各個階段，但是目前對大多數效應蛋白的功能研究相對較少，為了深入了解效應蛋白的功能，現將國內外研究較多的效應蛋白的生物學功能歸納如下。

3.1 形成保護性LCV，避免與溶酶體融合 研究[37-38]表明：Dot/Icm系統缺陷的嗜肺軍團菌突變株被宿主吞噬后，可與酸性LAMP1-陽性的溶酶體結合而被消滅；而Dot/Icm系統完整組裝后，則可直接阻斷與溶酶體的結合。嗜肺軍團菌效應蛋白可通過俘獲宿主胞內參與囊泡轉運的重要蛋白，從而干擾宿主囊泡的轉運；同時通過俘獲宿主胞內的內質網-高爾基體囊泡，形成可保護自身的寄生性囊泡LCV使其不被溶酶體識別消化，幫助其在宿主胞內的存活與增殖[39-40]。這些效應蛋白包括SidM、SidD、LidA、LepB、RalF、AnkX/Lem3、VipA、VipD、SidC、SidE、SidJ、LseA、PieE、LegG1、RidL 和YlfA/LegC7等[41]。

SidM (DrrA) 具有鳥苷酸交換因子 (GEF) 和鳥苷酸解離抑制因子釋放因子 (GDF) 雙重活性，并可對Rab1蛋白特異性識別；而Rab蛋白作為一種分子開關，在囊泡的出芽、轉運、黏附、錨定、融合的各階段發揮重要作用[40, 42-43]。嗜肺軍團菌SidM正是通過俘獲介導宿主內質網-高爾基體轉運的關鍵因子Rab1，使其形成成熟的LCV。首先SidM 通過對Rab1 的特異性識別，與AnkX 和Lem3一起輔助解離Rab1-GDI 復合物，并與LidA共同完成對Rab1 的競爭性俘獲和穩定，參與Rab1激活和AMP化修飾。在調控后期，SidD 通過對Rab1的AMP化修飾，促進LepB 識別并水解Rab1-GTP，使Rab1 再次回到活性關閉狀態，并從LCV 上脫離且被胞內GDI 回收，構成完整的膜循環[41, 44-46]。 此外，VipA和VipD在嗜肺軍團菌調控宿主囊泡轉運過程中亦發揮了重要作用。VipA通過參與肌動蛋白的結合與聚合而調控囊泡轉運，VipD通過阻止一些小G 蛋白(如Rab5、Rab22)進入正常的膜循環，抑制宿主溶酶體成熟[47-48]。

3.2 激活抗凋亡NF-κB通路，抑制宿主細胞凋亡 嗜肺軍團菌感染早期需要在宿主細胞內大量繁殖從而侵染細胞，因此，宿主細胞的過早凋亡對軍團菌的增殖與侵染極其不利。致病性嗜肺軍團菌可通過向宿主胞內分泌效應蛋白調控宿主抗凋亡基因的表達，來抑制細胞凋亡或延長細胞的存活時間。例如，可以通過正向調節NF-κB 通路(細胞免疫反應的主要調控因子)以延緩宿主細胞的凋亡。研究[49-50]表明：Dot/Icm 底物效應蛋白LegK1、LnaB、SdhA、sidF 和LubX等可能參與激活宿主細胞抗凋亡NF-κB 通路。例如，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 (STPK) LegK1，能模擬宿主的IκB 而激活宿主的NF-κB 信號轉導通路，在宿主細胞中顯示出很強的NF-κB 信號活性，從而能起到防止宿主細胞過早凋亡的作用。某些蛋白激活宿主NF-κB 活性的機制尚不完全明確，可能是多個效應蛋白協同作用的結果。

3.3 促使宿主細胞死亡，從宿主細胞中逃逸 嗜肺軍團菌生命周期的最后一步是成功從宿主細胞中釋放出來。LepA和LepB是兩個具有卷曲螺旋結構域 (coiled-coil domain) 的效應蛋白，可能參與宿主裂解死亡過程。研究[51-52]發現：嗜肺軍團菌LepA和LepB缺失株與野生株相比，在宿主細胞內的增殖能力無顯著差異，而從原生動物細胞中釋放的能力卻顯著下降。這些研究說明LepA和LepB很可能在裂解宿主細胞的過程中發揮了重要的作用，可幫助嗜肺軍團菌從宿主細胞中成功逃逸。

3.4 帶有真核蛋白序列基元效應蛋白的生物學意義 嗜肺軍團菌基因組特征分析發現其基因組相當大，可編碼大量類真核生物蛋白或編碼的蛋白具有真核生物蛋白的保守結構域。例如，上文提到的STPK LegK1可通過激活宿主的NF-κB 信號轉導通路而抑制宿主細胞過早凋亡；STPK LegK3可引起較弱的酵母菌生長抑制且可調節酵母菌屬的囊泡轉運[53]。通過觀察酵母胞內LegK3與肌動蛋白細胞骨架和內質網到高爾基體的小泡之間的共同定位現象，可以發現他們之間存在相關作用[54]，但具體作用機制尚不明確。嗜肺軍團菌可表達多種真核效應蛋白，這些蛋白可介導蛋白質間的相互作用，是一類潛在的毒力因子[55]。

3.5 效應蛋白的其他生物學功能 嗜肺軍團菌某些效應蛋白還具有其他方面的生物學功能。例如：RomA含有甲基轉移酶的SET 結構域，可甲基化修飾宿主細胞核質，抑制宿主基因表達[56]；LegU2具有U-box結構域，具有E3泛素化連接酶的活性，介導泛素化細胞周期蛋白Clk1，阻礙宿主細胞周期進程[57]；黏附相關效應蛋白SdeA可促進細菌內化[58]；鞭毛蛋白FliC (FlaA) 可促進細胞炎性壞死 (又稱細胞焦亡) 和細菌釋放[59-60]；SidK 通過靶向結合宿主v-ATP酶，抑制ATP 水解，阻止液泡酸化[61]；RidL可與內吞體分選 (endosomes sorting) 重要復合物Retromer結合，抑制其介導的囊泡物質轉運，以幫助嗜肺軍團菌的生存與增殖[62]；SdeA能以一種特殊方式催化泛素化(蛋白質翻譯后修飾方式之一)過程[63]等。

嗜肺軍團菌除能產生酶類、毒素、菌毛和微莢膜等致病物質外，還具有獨特的Dot/Icm IVB型毒力分泌系統，能夠向宿主細胞分泌超過300種效應蛋白，而這些效應蛋白在其致病過程中亦發揮著重要的生物學功能，被列為廣義的毒力因子。

這些效應蛋白的生物學功能主要表現在以下三個方面：(1)侵染早期形成保護性LCV，有效避免與溶酶體融合而得以在胞內存活與增殖。(2)侵染過程通過激活宿主NF-κB通路抗宿主細胞凋亡；通過抑制宿主細胞的凋亡增加對其營養物質的利用，可以在宿主胞內更長久的存活與增殖。(3)侵染后期，通過裂解LCV或宿主細胞，促進宿主細胞凋亡或焦亡等方式幫助嗜肺軍團菌從宿主細胞中順利釋放，實現進一步侵染。參考文獻[64]現將報道較多的嗜肺軍團菌效應蛋白歸納總結，見表1，含文中未提及的SidI、Lgt1、MavN和RavZ等效應蛋白。

表1 嗜肺軍團菌效應蛋白在胞內增殖過程中對宿主細胞的作用途徑

4 總結與展望

嗜肺軍團菌是一種可引起軍團病(包括高致死性軍團菌肺炎和龐蒂亞克熱)的病原菌。我國已將軍團病列為需要重點防治的一種新發傳染病。因此，針對嗜肺軍團菌開展致病機制相關研究十分必要。

當前，嗜肺軍團菌絕大多數效應蛋白的晶體結構和生物學功能尚未完全闡明，且效應蛋白在調控表達的信號通路、與宿主靶蛋白及宿主各調控信號網絡的相互作用等方面的研究尚在起始階段。全面深入地研究這些效應蛋白對于詳細闡明嗜肺軍團菌的致病機制具有重大意義，也為軍團病的防治提供理論基礎和新的藥物靶標。此外，嗜肺軍團菌作為一種研究胞內病原菌致病機制的理想模型，可為結核分枝桿菌、傷寒沙門菌等胞內菌與宿主先天性免疫系統間的復雜信號調控網絡研究給予重要啟示。