PD-L1+巨噬細胞在腫瘤發生發展中的研究進展*

黎貴蕓 邊莉

癌癥的發生發展既是多基因參與、多階段逐漸形成所致，又是腫瘤細胞與其所處微環境的適應性過程。腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）由細胞外基質、血管、浸潤的炎癥細胞、多種相關的組織細胞和細胞因子、生長因子以及代謝物、微生物菌群等所形成的復雜網絡［1］，其為腫瘤細胞賴以生存的“土壤”，為腫瘤細胞生長、播散提供必要條件，在這片“土壤”中，巨噬細胞為關鍵的參與者。

巨噬細胞為固有免疫的重要組成部分和適應性免疫啟動的關鍵因子，不同組織中的巨噬細胞具有不同的功能，如小膠質細胞促進神經元存活、脾紅髓巨噬細胞能夠去除衰老的紅細胞［2-3］。巨噬細胞可塑性極強，在特定的環境、不同的刺激因素下塑造出的特性、活化狀態、表型和功能各不相同，主要分為抵御細菌感染、激活免疫、抑制腫瘤發生的經典活化型（M1）巨噬細胞，和化療耐藥、免疫抑制、促進腫瘤發展的交替活化型（M2）巨噬細胞，M1和M2型為巨噬細胞活化的兩種極端表型［4］，也是傳統的巨噬細胞分型方式。但是大部分實驗中活化的巨噬細胞并不完全隸屬于M1或M2，而是處于二者之間不斷轉化的狀態［5］，鑒于M1、M2的復雜性，為了標準化實驗流程，有研究建議巨噬細胞的分型應該包括3項原則：1）巨噬細胞的來源（人外周血單核細胞、小鼠骨髓、小鼠腹膜巨噬細胞等）；2）激活劑類型（M＜IL-4，interleukin-4＞，M＜Ig，immunoglobulins＞，M＜IL-10＞，M＜interferon-γ，IFN-γ＞，M＜lipopolysaccharide，LPS＞等）；3）巨噬細胞活化的標記［6］。

1 巨噬細胞的起源與自行更新

巨噬細胞主要由骨髓中的造血干細胞（hemato?poietic stem cells，HSCs）分化產生或胚胎時期卵黃囊（yolksac，YS）中祖細胞衍生而來［7-8］。目前，公認的研究確定巨噬細胞有3種不同的發育途徑：1）組織駐留巨噬細胞（tissue resident macrophage，TRMs）：這群細胞主要包括卵黃囊或胎肝祖細胞衍生的巨噬細胞前體。胚胎巨噬細胞的起源分為兩個階段，在原腸胚早期（embryonic day 6.5-8.5，E6.5-8.5），從胚外中胚層的YS 出現第一種具有造血功能的前體細胞，啟動早期造血功能，產生巨噬細胞及其他有核細胞，這一階段稱為早期造血階段；之后紅髓系祖細胞（erythromyeloid progenitor，EMP）在E8.5～E10.5 后遷移進入胎肝（fetal liver，FL），并在FL里分化為包括巨噬細胞在內的多種細胞［9］。中樞神經系統的小膠質細胞為胚胎巨噬細胞的典型代表，穩態條件下通過局部增殖實現自行更新并持續到成年期［10］；2）造血干細胞HSCs 來源的巨噬細胞：真皮、腸道、脾臟邊緣的胚胎巨噬細胞在出生后迅速被HSCs 的單核細胞取代，并依賴單核細胞募集替代更新［11-13］；3）混合來源的巨噬細胞：有研究將CD45.1；Myb+/+小鼠的骨髓細胞移植到CD45.2；Myb-/-小鼠體內，發現受體小鼠外周組織巨噬細胞表達CD45.1，而肺、脾、腎中混有表達CD45.1 和CD45.2 的巨噬細胞，表明這些組織中的巨噬細胞群既有組織駐留的巨噬細胞，又有造血干細胞來源的巨噬細胞［14］。

2 腫瘤相關巨噬細胞

浸潤到腫瘤中的巨噬細胞稱為腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAMs），與正常的巨噬細胞相比，TAMs 為一種傾向于免疫抑制表型、分化不完全的巨噬細胞。新近研究表明，在腫瘤中胚胎來源的巨噬細胞與單核細胞衍生的巨噬細胞可能具有不同的表型和功能［15-17］，通常認為TAMs 主要源自循環單核細胞，但肺癌和胰腺癌小鼠模型中發現高達50%的巨噬細胞為組織常駐巨噬細胞，在上述腫瘤中，HSCs 起源的TAMs 參與免疫抑制和抗原呈遞，胚胎衍生的TAMs 負責組織重塑和傷口愈合。腫瘤微環境中的各類細胞因子對巨噬細胞的募集極其重要，CCL-2/CCR2、CCL-5/CCR5 等趨化因子軸可募集血液中的單核細胞/巨噬細胞到腫瘤區域，腫瘤細胞分泌的IL-10、巨噬細胞集落因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）等也可促進巨噬細胞向腫瘤部位遷移，另外，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）、透明質酸（hyaluronic acid，HA）等也參與巨噬細胞的招募與轉運［18］。癌細胞與巨噬細胞之間的互作通過多種細胞因子實現，腫瘤細胞招募大量的巨噬細胞到腫瘤部位，而TAMs又反過來分泌多種細胞因子維持腫瘤細胞增殖、重塑細胞外基質、誘導血管和淋巴管新生，為腫瘤的生長、侵襲和轉移提供條件［19］。TAMs 通過表達分泌不同的調節分子如內皮細胞酪氨酸激酶-2（tyrosine kinase-2，Tie2），集落刺激因子-1（colony stimulating factor-1，CSF-1）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）構成腫瘤轉移微環境來加速腫瘤細胞活化、腫瘤血管再生、腫瘤細胞侵襲和轉移［20-22］。

3 腫瘤相關巨噬細胞中PD-L1的調節機制及其在腫瘤中的作用

程序性死亡受體-1配體（programmed death receptor-1 ligand，PD-L1）也稱為B7-H1或CD274，屬于B7家族的細胞表面糖蛋白。在生理條件下，組織細胞表達的PD-L1 與淋巴細胞表面的程序性死亡受體-1（pro?grammed death receptor-1，PD-1）結合使機體免受過度炎癥反應造成的損害，同時也在自身免疫耐受及防治自身免疫性疾病中發揮重要作用［23］。當腫瘤發生時，高表達PD-L1的腫瘤細胞，抑制淋巴細胞的功能及細胞因子的釋放，誘導淋巴細胞凋亡，從而抵抗淋巴細胞的殺傷作用，發生腫瘤免疫逃逸［24］。

PD-L1 介導的免疫抑制還受蛋白質糖基化和泛素化的廣泛調控，多數細胞表達的PD-L1 具有高度糖基化的模式［25］，蛋白印跡實驗可檢測到33 kDa 的非糖基化PD-L1和45～55 kDa糖基化PD-L1，PD-L1蛋白胞外結構域T180 和S184 區域有糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）的磷酸化基序，非糖基化的PD-L1 在GSK3β 磷酸化作用后會被泛素/蛋白酶體系統降解［26］。PD-L1除了通過增加自身糖基化水平穩定自身蛋白外，還可以通過降低自身泛素化水平延長蛋白半衰期，腫瘤相關巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）觸發核因子κB（nuclear factor κappa-B，NFκB）途徑，誘導癌細胞表達去泛素化酶，抑制PD-L1的泛素化降解，從而增強PD-L1/PD-1相互作用以避開T 細胞免疫監視［25］。趨化素樣因子MARVEL 跨膜結構域超家族-6（chemokine-like factor MARVEL transmembrane domain containing 6，CMTM6）蛋白可阻止PD-L1 與E3 泛素連接酶（STIP1 homology and U-box containing protein 1，STUB1）產生泛素化來延長PD-L1 蛋白的半衰期，小鼠黑色素瘤模型中敲除CMTM6 會下調PD-L1 表達，增強腫瘤特異性T 細胞活性［27-28］。除了腫瘤細胞，腫瘤相關巨噬細胞也可高表達PD-L1，并通過不同的機制介導免疫調節。

高表達PD-L1 的TAMs 介導免疫調節主要通過與CD8+T 淋巴細胞上的PD-1 受體結合，募集并激活磷酸酶SHP2，引起下游蛋白激酶Syk 和PI3K 的去磷酸化，進而下調mTOR、AKT 和ERK2 等通路的信號，抑制效應T細胞的增殖、存活及IFN-γ和TNF-α的分泌，發揮負向調控T 細胞活性的作用，并介導其發生凋亡，導致殺傷腫瘤的淋巴細胞數量減少，削弱免疫系統的抗腫瘤效應［29］。

3.1 TAMs表達PD-L1的調控機制

在巨噬細胞表達PD-L1的調節機制中，細胞因子、趨化因子的誘導和維持作用最重要，見圖1。有研究通過體外培養腹腔巨噬細胞，模擬富含巨噬細胞的腫瘤微環境。研究發現，活化T細胞分泌的INF-γ介導巨噬細胞高表達PD-L1，阻斷INF-γ后PD-L1的表達下調［30］。淋巴瘤細胞分泌的可溶性因子IL-27B（EBI3）激活Stat3途徑調控TAMs表達PD-L1，而TAMs衍生的IL-27p28與淋巴瘤衍生的IL-27形成異二聚體IL-27，也能夠參與調控PD-L1的表達［31］。腦膠質瘤細胞自分泌/旁分泌IL-10，激活Akt/PI3K信號通路，上調單核巨噬細胞表達PD-L1［32］。腫瘤細胞分泌的CSF-2可誘導巨噬細胞分泌CXCL8，CXCL8進而上調巨噬細胞表達PD-L1［33］。分泌性磷蛋白（secreted phosphoprotein 1，SSP1）也是調控TAMs中PD-L1表達的重要因子，抑制SPP1的表達，則下調M2 型巨噬細胞PD-L1、IL-10 和精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）的表達［34］。巨噬細胞PD-L1的表達還可通過自身COX2/mPGES1/PGE2通路調節［35］。

圖1 腫瘤微環境中TAMs表達PD-L1的調控機制

巨噬細胞表達PD-L1除了受特定細胞因子的調節外，還受內源性致癌途徑的調控。有研究在白血病、肝細胞癌Tet-off 轉基因小鼠模型中發現，抑制myc 基因表達，可導致巨噬細胞PD-L1 蛋白水平降低，體外實驗研究發現myc通過與編碼PD-L1基因的啟動子區域結合而直接調控PD-L1 的基因表達［36］。自噬（autophagy）、缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等在巨噬細胞表達PD-L1的調控作用中也發揮重要作用。腫瘤細胞釋放的自噬體TRAP 誘導巨噬細胞向M2型轉變，并通過TLR4-MyD88-p38-STAT3信號通路上調腫瘤相關巨噬細胞PD-L1 和IL-10 的表達，抑制T 細胞增殖、促進腫瘤生長［37］。有研究通過染色質免疫沉淀和熒光素酶報告基因檢測發現缺氧誘導因子HIF-1α 與PD-L1 近端啟動子中的乏氧反應元件HRE 直接結合，選擇性上調巨噬細胞PDL1 的表達，在缺氧條件下阻斷PD-L1 的表達可下調巨噬細胞表達IL-6 和IL-10，阻斷巨噬細胞介導的T細胞活化作用［38］。ROS則可通過轉錄因子NF-κB介導巨噬細胞上調PD-L1 的表達［39］。除此之外，有研究通過對非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）、腎細胞癌、黑色素瘤行免疫組織化學染色發現，程序性死亡受體-2配體（programmed death recep?tor-2 ligand，PD-L2）蛋白與PD-L1 蛋白存在明顯的位置相關性，并且與其他細胞因子上調PD-L1一致，PD-L2 也驅動調節PD-L1 的表達［40］。而在BRCA1/P53缺失的乳腺癌小鼠模型中，紫杉醇治療可誘導體內腫瘤相關巨噬細胞表達PD-L1，導致出現免疫抑制性腫瘤微環境［39］。

3.2 PD-L1+的TAMs與腫瘤的關系

TAMs的存在通常與實體瘤的不良預后相關。有研究證實，TAMs表達PD-L1后腫瘤微環境處于免疫抑制狀態。腫瘤基質細胞中的PD-L1表達為總體生存期的獨立預測因子。膽管細胞癌中，PD-L1陽性病例中巨噬細胞的數量顯著高于PD-L1陰性，并且PD-L1陽性的患者總生存期比PD-L1陰性的患者差［41］。在肝細胞癌中大量PD-L1+巨噬細胞的浸潤與患者總生存期（overall survival，OS）和無病生存期（disease frss survial，DFS）呈負相關，腫瘤周圍基質中巨噬細胞的密度與腫瘤大小、腫瘤多樣性和淋巴結轉移相關［42］。有研究在113例Ⅰ期NSCLC中發現，腫瘤細胞和巨噬細胞低表達PD-L1的患者5年OS為94%，顯著高于腫瘤細胞和巨噬細胞高表達PD-L1的患者（OS為20%）［43］。

但PD-L1+的TAMs 與腫瘤的關系仍存爭議。肝細胞癌中PD-L1+巨噬細胞的浸潤密度與OS 和無復發生存期（relapse-free survival，RFS）呈正相關，PDL1+巨噬細胞浸潤的腫瘤中CD8+T 細胞密度顯著升高，免疫應答相關基因IFNG、GZMB 和PRF1 表達也升高［44］，說明PD-L1+巨噬細胞在腫瘤中表現出免疫活化的狀態，對患者的預后具有保護作用。在原發性睪丸淋巴瘤中PD-L1+CD68+的巨噬細胞可作為獨立預后因素［45］。有研究發現，PD-L1陽性的胃癌樣本中具有M2 樣表型（CD163+）的巨噬細胞的密度顯著高于PD-L1 陰性的樣本，其陽性表達密度雖與患者年齡、性別、腫瘤大小、Lauren分型和腫瘤分期等臨床參數無明顯相關性，但可作為一個潛在靶向治療的指標［46］。研究證實，腫瘤中浸潤的PD-L1+巨噬細胞還與抗PD-L1 抗體的療效相關。有研究在近500 例NSCLC 中發現，80%的CD68+巨噬細胞表達PD-L1，在抗PD-1/PD-L1治療時，這部分患者有更長的OS［47］。

3.3 PD-L1免疫組織化學定量檢測標準

腫瘤中巨噬細胞PD-L1 免疫組織化學（immuno?histochemistry，IHC）染色評分與抗PD-1/PD-L1的療效相關，既往臨床研究表明，NSCLC中浸潤的巨噬細胞PDL1 IHC結果呈3分（陽性細胞%＜1%為0分，1%≤陽性細胞%＜5%為1分，5%≤陽性細胞%＜10%為2分，≥10%為3分）的患者對抗PD-L1抗體MPDL3280A治療反應明顯，僅17%患者疾病進展，而腫瘤細胞PD-L1免疫組織化學染色結果呈3分的NSCLC患者中有38%患者疾病進展惡化［48］。Powles等［49］在205例轉移性尿路上皮癌的研究中也發現，患者對抗PD-L1抗體MPDL3280A的治療效果與腫瘤浸潤性巨噬細胞PD-L1的IHC評分相關，但與腫瘤細胞IHC評分無關。

目前，中性福爾馬林固定石蠟包埋組織（formalin fixation and paraffin embedding，FFPE）的PD-L1 IHC評分為確認患者是否接受抗PD-1/PD-L1治療的唯一依據，但現階段采用的評分方法、取用的臨界值因PD-L1抗體克隆號、腫瘤類型和抗PD-1/PD-L1藥物的不同而不同。結合文獻及相關資料，現有詳細判讀細則的檢測抗體有Dako 22C3和VENTANA SP142、SP263，見表1。Dako 22C3檢測試劑盒僅對腫瘤細胞PD-L1染色進行判讀，VENTANA SP142和SP263檢測試劑的判讀包含腫瘤細胞和腫瘤浸潤免疫細胞PD-L1染色的判讀（表1數據來自下述官網：1）https：//www.agilent.com；2）http：//reagent-catalog.roche.com；3）http：//reagent-catalog.roche.com）。

表1 PD-L1免疫組織化學判讀

4 結語

TAMs 作為腫瘤微環境中重要的組成成分，在腫瘤的發生、發展和侵襲轉移過程中發揮重要作用。在臨床研究中，巨噬細胞已成為當前腫瘤治療的熱點，卻因其復雜的機制網絡，尚不能靈活運用。PDL1+的巨噬細胞在臨床研究中尚存爭議，這可能與TAMs 表型不同有關。因此，通過分析不同起源、不同表型的TAMs在腫瘤中發揮的作用以及更新機制，為尋找抗腫瘤治療的精準靶點提供理論依據。