Chk1激酶在惡性血液腫瘤中的研究進展

劉繼敏，文飛球，2

(1.遵義醫科大學珠海校區，廣東 珠海 519041； 2.深圳市兒童醫院血液腫瘤科，廣東 深圳 518000)

血液腫瘤是一類造血系統惡性增殖性疾病，近年來發病率呈全球性增長的趨勢[1]。血液腫瘤主要包括白血病、淋巴瘤和多發性骨髓瘤，隨著治療技術的不斷改進，部分淋巴瘤和白血病的療效雖有了很大程度的提高，但仍有部分患者易耐藥、易復發，病情可急劇惡化，導致預后較差、病死率較高。因此，尋求新的分子靶點、開發出新的治療方案、提高治療效果是當前急需解決的問題。近年來，細胞周期檢查點激酶1(checkpoint kinase 1，Chk1)在血液系統腫瘤發病中的作用引起人們的關注，其最初被認為是一種腫瘤抑制因子，但隨著研究的深入發現，Chk1可促進腫瘤生長[2]。Chk1在多種人類腫瘤如乳腺癌、肝癌、胃癌、宮頸癌、血液腫瘤等中過表達，其過表達也與部分血液腫瘤的耐藥、復發及不良預后密切相關[3]。正常細胞存在完整的G1期和S/G2期細胞周期檢查點，DNA損傷因子的刺激可產生復制應激，通過共濟失調毛細血管擴張癥突變激酶(ataxia telangiectasia mutated kinase，ATM)/p53途徑激活G1期和S/G2期檢查點，抑制復制應激，修復DNA損傷，促進細胞的生存。然而，包括部分血液腫瘤在內的腫瘤細胞往往缺乏ATM/p53信號，導致G1期檢查點調控缺陷，通過依賴共濟失調毛細血管擴張癥和Rad3相關激酶(ataxia telangiectasia and Rad3 related kinase，ATR)/Chk1途徑激活S/G2期檢查點以修復DNA損傷[4]。遺傳學研究證實，Chk1的失活或抑制會破壞由DNA損傷引發的細胞周期阻滯，且Chk1抑制劑可促進部分腫瘤細胞死亡[5]?，F就Chk1的生物學特點、與血液腫瘤的關系及Chk1抑制劑在血液系統腫瘤中的應用進行綜述。

1 Chk1概述

Walworth等[6]在尋找與細胞周期調節激酶p34cdc2相互作用的成分時發現了一種新型裂殖酵母蛋白激酶同源物，并將編碼該蛋白的基因命名為Chk1。Chk1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分子量約為54 000，人類Chk1基因位于染色體11q24，由476個氨基酸組成，在進化上高度保守[7]。Chk1由N端的激酶結構域、C端的抑制性結構域、中間的可變連接域以及絲氨酸-谷氨酰胺/蘇氨酸-谷氨酰胺調節域四部分組成，其中N端是催化底物磷酸化的激酶區域，C端是接受磷酸化調節的絲氨酸/谷氨酰胺區[7]。

有研究表明，Chk1在調節細胞周期、參與DNA損傷修復中發揮著關鍵作用，并可影響細胞的存活和凋亡，參與胚胎的生長發育等[8]。在正常細胞周期中，Chk1調節S期DNA的復制、G2/M期和M期的進入以及M期紡錘體和染色體的組裝，并可調節細胞對氧暴露、蛋白質異常折疊以及人類免疫缺陷病毒感染的應激等[2，9-10]。此外，Schuler等[11]研究發現，Chk1對維持造血系統功能也有重要作用，但在早期造血干細胞動力學以及成熟血細胞穩態中的作用仍需進一步探索。

1.1Chk1與細胞周期調控 細胞周期的連續性和DNA復制的保真性對基因組的穩定性以及腫瘤抑制至關重要。正常情況下，為保證有絲分裂的順利啟動和細胞周期的完整性，細胞周期受周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)等調控蛋白和檢查點機制的嚴格調控。在哺乳動物細胞中存在G1/S期、S期、G2/M期以及有絲分裂檢查點，當DNA損傷時，細胞通過Chk1和Chk2啟動細胞周期阻滯，其中Chk1使細胞周期停滯在S期或G2期，阻止DNA受損的細胞進入有絲分裂；而Chk2使細胞周期停滯在G1期，以確保細胞正常進入下一個階段[12]，為DNA損傷修復爭取時間，提高細胞存活率，或通過凋亡途徑促進細胞死亡。

1.2Chk1與DNA損傷應答(DNA damage response，DDR) 人類基因組DNA受多種因素影響，包括內部因素和外部因素。這些因素共同作用可能導致遺傳信息發生不同程度的改變，如DNA突變、DNA單鏈斷裂、DNA雙鏈斷裂等。為防止突變基因傳遞給下一代，人體衍生出一套復雜且高度協調的信號轉導通路網絡，稱為DDR[13]，其可避免細胞受到DNA的持續損害。正常細胞有完整的檢查點信號通路，DNA損傷后細胞的存活依賴于檢查點的激活并啟動DNA損傷修復系統。DDR有兩條重要的信號通路：一條是ATM-Chk2-細胞分裂周期蛋白25(cell division cyclin 25，CDC25)信號通路，當DNA發生雙鏈斷裂時，該信號通路被激活；另一條信號通路是ATR-Chk1-CDC25信號通路，當DNA發生單鏈斷裂時被激活，啟動DNA損傷修復系統，上游ATR將DNA受損信號通過中介因子傳遞至Chk1，Chk1定位聚集在DNA損傷位點，并被ATR Ser317/345兩個位點磷酸化激活，然后Chk1磷酸化抑制其下游的CDK激活物CDC25A，使CDC25A加速泛素化并降解，從而抑制CDK的激活，促使細胞周期阻滯于S/G2期或G2/M期[14-15]。同時，Chk1磷酸化激活CDK的拮抗劑Wee1，導致G2期延遲，為DNA損傷修復創造條件；若受損嚴重難以修復，則誘導細胞凋亡防止惡變，促進復制叉的穩定和重新啟動，從而維持基因組的穩定性[14-15]。

2 Chk1與血液腫瘤

Chk1在多種人類腫瘤中均顯示出過表達的現象。對轉基因小鼠的研究發現，高水平Chk1通過抑制復制應激促進癌基因誘導的致癌轉化[16]。Chk1對癌細胞的增殖與生存均有重要作用[17]，與Chk1低表達腫瘤細胞相比，Chk1高表達腫瘤細胞更能耐受放療、化療或其他腫瘤治療方法(如組蛋白去乙?；敢种苿?引起的DNA損傷反應，促進產生惡性程度更高的腫瘤細胞，并可導致耐藥現象的發生及腫瘤的頻繁復發[18]。以上研究提示，Chk1在腫瘤的發生發展中發揮重要作用。

2.1Chk1與白血病 急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)按照免疫表型分為急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)和急性T淋巴細胞白血病(T-ALL)。T-ALL是一種由T細胞前體克隆擴增引起的惡性血液腫瘤，由于大量基因損傷，導致細胞CDK過度激活和S期進展失調，進而導致DNA復制受損，使T-ALL細胞趨向于高度增殖?；蚪M的穩定性直接關系到細胞的癌變，其中DNA復制是最易發生變化的過程，也是最易致癌的過程。任何導致DNA高水平損傷的發生條件都會引發復制應激，這是基因組不穩定的來源之一，也是癌變前細胞和癌變細胞的一大標志。Sarmento和Barata[19]發現，Chk1在T-ALL中存在過度表達和過度激活，認為其與高水平的復制應激有關。該研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應和免疫印跡法發現，實驗組Chk1信使RNA轉錄水平和蛋白質表達水平均明顯高于正常對照組，且Chk1信使RNA轉錄水平在不同T-ALL亞組之間也存在差異，增殖組和TAL-LMO亞群的表達顯著高于TLX和ETP-ALL亞群組；Chk1抑制劑可促進T-ALL細胞死亡，呈劑量和時間依賴性方式抑制T-ALL細胞增殖，并可顯著延遲T-ALL白血病動物腫瘤的生長[17]。該研究認為，Chk1通過下調復制應激和阻止ATM/胱天蛋白酶3依賴的細胞死亡在T-ALL白血病細胞的增殖和生存中發揮關鍵作用[17]。抑制Chk1會導致G2/M期檢查點缺失，使DNA復制不完全的T-ALL細胞異常進入有絲分裂，引發有絲分裂災難，導致細胞死亡[12]。此外，Chk1對控制復制應激的積累和防止T-ALL細胞凋亡也有重要作用[19]。

AML是一種難治愈且易復發的高風險血液系統腫瘤。研究證實，AML患者的細胞中存在Chk1的高表達[20]。阿糖胞苷是AML一線治療誘導和補救方案的基礎，在初發AML中，基于阿糖胞苷的方案可使高達80%的患者完全緩解，但超過50%的患者最終會復發，且在完全緩解率相同的條件下，Chk1高表達的細胞復發率較高，提示Chk1的表達水平與微小殘留和疾病復發持續存在相關性[3，21]。另有研究表明，在復發的AML患者中，阿糖胞苷可誘導突變率增加[22]。高水平的Chk1可通過增強復制叉的穩定使其重新啟動，從而保護AML細胞免受阿糖胞苷的毒性作用[23]，提示Chk1的表達水平可能與耐藥相關。David等[3]對198例AML患者進行多因素分析發現，Chk1高表達與使用阿糖胞苷和蒽環類藥物治療AML患者復發率增加和總生存期較短相關，高表達和低表達Chk1患者預測5年總生存期分別為29.5%和52.4%，因此認為Chk1高表達與不良預后相關。此外，CPX-351是美國食品藥品管理局批準用于治療相關性AML和伴有骨髓異常增生改變的AML的一種化療藥物，其總體生存率高于標準阿糖胞苷/蒽環類藥物化療[24]。有研究發現，敲除或抑制Chk1可增強CPX-351誘導的多個AML細胞系的凋亡，并增加了CPX-351在體外對原發性AML細胞的抗增殖作用[25]。Yuan等[26]研究發現，抑制Chk1基因的表達可降低FMS樣酪氨酸激酶3-內部串聯重復陽性AML細胞的增殖。

2.2Chk1與淋巴瘤 淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤亞型，往往過表達MYC，MYC驅動的復制應激可導致DNA損傷，影響基因組的穩定性[27]。抑制Chk1可誘導DLBCL細胞系和DLBCL原代細胞中DNA的快速積累，阻止增殖，并促進細胞凋亡[28]。研究發現，Burkitt淋巴瘤中MYC信使RNA的表達與Chk1表達顯著相關，且Chk1的表達受MYC和細胞周期轉錄因子E2F癌基因控制[16]。采用免疫組織化學法分析多種淋巴瘤亞型中Chk1的表達水平發現，與其他B細胞淋巴瘤亞型相比，Burkitt淋巴瘤患者Chk1的表達水平明顯更高[29]。在小鼠淋巴瘤中，有效抑制Chk1能夠顯著延緩疾病進展，提示Chk1表達的失調可能與淋巴瘤預后有關[8]。

3 Chk1抑制劑在血液系統腫瘤治療中的應用

當Chk1被抑制時癌細胞會失去對DNA損傷的反應和修復能力，從而增強化療或放療對細胞的殺傷力。Chk1抑制劑與化療或放療相結合可能在癌癥的治療中發揮著化放療增敏的作用[13]。白血病和淋巴瘤細胞易受Chk1損耗的影響，已有研究證明了Chk1抑制劑作為治療B/T-ALL和淋巴瘤新策略的有效性[5，30]。迄今為止，已有多種Chk1抑制劑作為增敏劑用于包括血液腫瘤在內的多種腫瘤的治療。臨床前期和早期臨床研究顯示，部分Chk1抑制劑具有單藥活性，與抗代謝藥或靶向制劑聯合使用能有效抑制Chk1，發揮抗腫瘤作用[28，31]。目前，與血液腫瘤研究相關的Chk1抑制劑有UCN-01、AZD7762、MK-8776、PF-00477736、LY2606368。

UCN-01是第1代Chk1抑制劑，為Chk1/2雙重抑制劑，可增強電離輻射和抗癌藥物對包括血液腫瘤在內的多種腫瘤細胞系的毒性。但由于該化合物不穩定的藥動學特性和較多的不良反應，臨床試驗尚未取得進展[32]。AZD7762是一種強效的Chk1/2雙重抑制劑，其功能主要依賴于對Chk1的抑制，聯合化療藥物可阻止腫瘤生長，特別是p53突變或缺失的腫瘤[33]。有研究指出，p53可能不是Chk1抑制劑療效唯一的決定因素[34]。Restelli等[35]研究證實，AZD7762與ATR抑制劑組合在淋巴瘤細胞系(DLBCL和套細胞淋巴瘤)中有較強的協同作用，但因其心臟毒性和多重不良反應而終止臨床試驗。

MK-8776 (即SCH 900776)是一種高效選擇性Chk1抑制劑。研究發現，該藥物可增加DNA抗代謝物羥基脲、吉西他濱對腫瘤細胞的毒性作用，在體內外均表現出化學敏感性，且對正常組織無影響[36]。Ⅰ期試驗表明，MK-8776與Ara-C聯用的耐受性和療效均較好[37]，兩者聯合治療難治性急性白血病正在行Ⅱ期臨床試驗。此外，Suzuki等[38]研究證明，在最低毒性濃度下，MK-8776具有很強的輻射增敏作用，但目前尚未見該作用在血液腫瘤中應用的報道。

PF-00477736是一種高效選擇性ATR競爭性Chk1抑制劑，在體內可增強紫杉烷類的抗腫瘤活性[18]。有研究顯示，PF-00477736對原發性T-ALL具有細胞毒性作用，可顯著延遲小鼠異種移植T-ALL腫瘤在體內的生長，單藥治療耐受性良好[17，39]。Derenzini等[28]證實，在DLBCL原代細胞中，隨著磷酸化Chk1的增加，PF-00477736可誘導DNA損傷積累，對侵襲性淋巴瘤細胞有選擇性細胞毒性作用，且不會誘導正常骨髓單核細胞發生特異性變化。另有研究表明，套細胞淋巴瘤細胞對PF-00477736單藥非常敏感，效果明顯強于其他B細胞淋巴瘤細胞系和上皮癌細胞系，聯用PF-00477736和Wee1抑制劑MK-1775可觀察到較強的協同作用[40]。布魯頓酪氨酸激酶抑制劑依魯替尼已被批準用于難治性套細胞淋巴瘤的治療，但仍有部分患者會出現耐藥。一項臨床前研究提示，PF-00477736與依魯替尼聯合用于套細胞淋巴瘤細胞系具有協同效應，極低濃度的PF-00477736便能增加依魯替尼的活性[41]。

LY2606368 (Prexasertib)是一種Chk1/2雙重抑制劑，在體外可優先選擇性結合并抑制Chk1[42]。有研究發現，LY2606368單藥治療顯示出良好的抗腫瘤效果，不僅增強了順鉑敏感腫瘤的療效，還能夠提高順鉑耐藥腫瘤的療效[43]。Ghelli Luserna Di Rorà等[39]研究發現，LY2606368單藥治療可降低白血病細胞活力，并具有劑量和時間依賴性，與伊馬替尼聯合使用對降低細胞活力具有協同疊加效應，但在正常細胞中并不會顯著降低細胞活力。此外，該藥物對鱗狀細胞癌具有一定的治療作用，目前處于Ⅱ期臨床試驗階段[44]。

新的Chk1抑制劑如CCT245737、GDC-0575、V158411、SRA737等仍在臨床前開發中，能不同程度的增強化療藥物或其他靶向制劑的作用[45-48]，期待其能更好地應用于臨床。

4 小 結

Chk1在DDR及細胞周期調控中具有重要作用，與部分血液腫瘤的發生發展、復發、耐藥及預后相關，可能是一個潛在的抗腫瘤治療靶點。臨床前期研究證實Chk1抑制劑治療血液惡性疾病有一定效果，但是否能僅通過調控Chk1抑制腫瘤的發生和進展尚不清楚。雖然Chk1抑制劑在化療增敏方面的前景看好，但部分抑制劑存在脫靶效應，且安全性也尚未得到證實[49]。此外，Chk1抑制劑與其他靶向S/G2期檢查點的抑制劑組合能否在抗癌治療中獲得滿意療效，還需要進一步探究。深入了解Chk1在血液腫瘤中的作用，發現新的預測生物標志物用于識別可能對不同類型Chk1抑制劑敏感或耐藥的患者，將有望提高惡性血液腫瘤的治療效益，為腫瘤患者帶來更好的生存預后。