角膜膠原交聯術治療圓錐角膜的研究進展

李金晶，薛勁松，蔣 沁，徐英男

0 引言

角膜膠原交聯術(corneal collagen cross-linking，CXL)是一種針對原發或繼發性圓錐角膜等角膜疾病的新療法[1]。角膜基質主要由大量排列規則的膠原纖維組成，正常情況下，這些膠原纖維與相鄰膠原之間存在著相互連接，為角膜基質提供一定的機械強度，而在圓錐角膜患者中，膠原間的相互連接減少，角膜機械強度減弱。Wollensak等[2]首次提出，通過角膜膠原交聯治療可使角膜強度增加，形態穩定，有效阻止或延緩圓錐角膜的進展。此外，膠原交聯還可增加膠原纖維的直徑，提高角膜基質對多種降解酶的抵抗作用。

核黃素作為光敏劑，在角膜膠原交聯中起到非常重要的作用：核黃素在370nm波長的紫外線照射下會產生單線態氧和活性氧，后者與各種分子間相互反應，誘導膠原纖維的氨基之間發生化學交聯反應，進而增加角膜機械強度、滯后量、阻力因子等生物力學特性。核黃素還可以使紫外線的能量在透過角膜時得以衰減，使角膜組織對紫外線的吸收率從32%提到至95%[3]，在核黃素存在時僅有7%的UVA能通過角膜[4]。

1 角膜膠原交聯術的臨床應用及進展

角膜膠原交聯術主要包括兩個步驟，一是將核黃素滲透到角膜膠原內；二是紫外線照射治療。通過改變核黃素的浸入方式和照射能量等條件可對經典的去上皮角膜膠原交聯術做出改良。

1.1加速交聯法經典去上皮角膜膠原交聯通常在去上皮后使用0.1%核黃素液滴眼，370nm波長的UVA照射30min，輻照度為3mW/cm2(能量劑量5.4J/cm2)。已有文獻證實，經典去上皮角膜膠原交聯可有效穩定圓錐角膜的進展，提高患者視力[5-8]。但經典去上皮角膜交聯方法耗時較長，存在患者依從性不佳等問題。Bunsen-Roscoe互易定律指出，無論施加的輻照度和時間如何，紫外光的光化學生物效應與所傳遞的總能量劑量成正比[9]。加速交聯法(accelerated CXL)作為一種改良方式，即在UVA交聯的背景下，遞送相同能量劑量，通過施加更高的輻照度來縮短治療時間，加速交聯在阻止角膜擴張的進展方面是安全有效的[10]。

大量臨床文獻對不同能量強度和不同照射時間的加速交聯方案進行了對比。Jeremy等[11]在對體外組織的角膜交聯實驗中發現，Bunsen-Roscoe互易定律僅在照射強度40～45mW/cm2以內有效，照射時間需超過2min。實驗設計包含了10組不同的能量強度和照射時間的對比，總能量劑量均為5.4J/cm2，與經典方法一致。當加速交聯的能量強度在40～45mW/cm2以內時，可以觀察到與經典交聯等效的楊氏模量增加。對比研究使用6mW/cm2照射15min、9mW/cm2照射10min、20mW/cm2照射4.5min、34mW/cm2照射2.65min、45mW/cm2照射2min的5組實驗中，楊氏模量增加值與3mW/cm2照射30min的經典交聯法相似，說明以上加速交聯方案可達到與經典交聯治療的類似效果；而當能量強度超過50mW/cm2，即照射時間短于2min時，并沒有統計學意義上楊氏模量的增加。證明能量強度并非越高越好，而是有一定的限度。這可能是由于加速交聯中高通量的照射治療會影響氧氣在基質中的滲透，從而改變經典交聯中基質共價鍵合成的有效性和治療的生物力學效率[12]。氧氣在角膜中的分布并不均勻，角膜各層的透氧性不同，氧氣通過角膜組織層的擴散是一個時間依賴的過程[13]。Kamaev等[14]在經典交聯法中測量了100μm深度下氧氣的滲透作用，發現在前10～15s，該層的氧氣濃度迅速下降，而在10min后隨著氧氣在組織中的滲透擴散，氧濃度逐漸上升。加速交聯縮短了操作時間，從而減少了氧在角膜中的滲透時間，影響了交聯反應的有效性。

Tomita等[15]使用30mW/cm2強度照射3min的加速交聯在遠視力及角膜曲率扁平化方面可達到與經典交聯相似的效果。Kymionis等[16]使用9mW/cm2強度照射10min發現經典交聯的治療深度大于加速交聯。當總能量劑量調整為126J/cm2時，使用9mW/cm2強度照射14min[17]和18mW/cm2強度照射7min[18]均觀察到與經典治療的交聯線深度無差異，證明不同總能量劑量條件下的加速治療方案也可以達到與經典交聯相似的效果。

1.2跨上皮交聯經典角膜膠原交聯術在手術中需要去除中央8mm范圍內的角膜上皮，術后有可能出現角膜上皮愈合遲緩、haze、角膜感染的風險，且上皮的缺失可能導致患者術后2～3d出現角膜刺激癥狀。

Lorelei等[19]首次提出了使用丁卡因破壞角膜上皮細胞間的緊密連接，而保留角膜上皮的交聯方法(transepithelial cornealcollagen cross-linking，TECXL)。術前使用丁卡因和核黃素溶液每隔5min滴眼一次，持續15min，兩種溶液滴眼之間等待1min。使用丁卡因滴眼替代去上皮操作可使核黃素進入基質，使大分子穿透上皮細胞。術中則將丁卡因和核黃素溶液浸透在兩塊海綿上，每10min將用丁卡因浸泡的海綿施于角膜表面，同時每3min將用核黃素浸泡的海綿施于角膜表面，UVA照射(3.0mW/cm2，370nm)，整個過程持續30min。

Filippello等[20]設計了角膜表面放置硅膠環，加長核黃素溶液在角膜表面的潴留時間，并以氨基丁三醇和 EDTA 作為核黃素促滲劑，治療雙眼發病的20例角膜厚度為380～444μm的圓錐角膜患者，術后未出現角膜基質混濁、感染等副作用，患者的角膜刺激癥狀大大減輕。術后9mo OCT 檢查發現Bowman氏膜以下的基質術后較術前增厚近100μm，術后18mo裸眼視力、最佳矯正視力、模擬角膜K值、角膜頂點屈光力以及高階像差等指標均有明顯改善。

Wollensak等[21]對14只金吉拉兔分別施行跨上皮角膜膠原交聯和經典去角膜上皮膠原交聯，結果顯示去上皮組楊氏模量增加102.45%，低價促滲劑的跨上皮組楊氏模量增加21.30%。組織形態學顯示在去上皮組角膜全層都存在細胞和內皮的缺失，而跨上皮組在接近200μm內有角膜細胞不均勻的缺失。該結果表明促滲劑聯合跨上皮膠原交聯改變角膜生物力學的效果僅為經典去上皮膠原交聯的近1/5，分析認為即使增加了促滲劑，但核黃素在角膜內的彌散程度還是明顯弱于去上皮組。

除促滲劑幫助核黃素導入角膜基質外，采用低滲核黃素溶液或者等滲核黃素溶液離子導入的方式是臨床上開展的另一種跨上皮交聯的方法。離子導入角膜膠原交聯術(iontophoresis corneal collagen cross linking，I-CXL)是利用電泳效應使攜帶核黃素的緩沖鹽在電場中運動，促進核黃素在角膜中彌散，增加基質核黃素，從而增加交聯效應。離子導入方法為將電極貼置于前額正中，罩杯置于角膜正中，抽吸負壓吸引空針使罩杯吸附于角膜表面，將核黃素注入罩杯內，通電后導入核黃素。Mastropasqua等[22]觀察比較了低滲CXL與I-CXL 5min組、I-CXL 10min組之間的早期療效。低滲組采用低滲核黃素點眼30min，離子導入組分別導入 5、10min，導入結束后使用與低滲CXL相同的紫外光照射儀，能量強度為10mW/cm2，照射時間為9min。術后1wk觀察，低滲CXL組分界線深度為152.7±42.9μm，I-CXL 5min 組分界線深度為213.6±42.3μm，I-CXL 10min組分界線深度為237.0±46.4μm；隨訪6mo后，UDVA、CDVA、Kmax在三組中基本保持穩定或有一定改善，其中以I-CXL 10min組的CDVA變化最顯著，這可能是因為離子導入組中的角膜基質核黃素濃度較低滲組高。

1.3 CXL在薄角膜中的應用UVA照射在核黃素的保護下，角膜細胞毒性輻照度水平僅為0.5mW/cm2，而無核黃素保護下的UVA照射，細胞毒性輻照度高為5mW/cm2，前者僅為后者的十分之一。在人角膜中使用核黃素-UVA聯合方法(表面輻照度為3mW/cm2)可將角膜損傷深度控制在角膜前300μm厚度以內[23]。Wollensak等[2]在一項動物實驗研究中表明，角膜內皮細胞毒性UVA劑量低于0.65J/cm2是行核黃素-UVA治療的安全劑量，在厚度大于350μm的角膜表面，使用的UVA照射劑量為3.6J/cm2(3mW/cm2，照射30min)，此時到達角膜內皮細胞的UVA照射劑量僅為0.54J/cm2，并認為該劑量是能產生有效機械加強效果并增加對酶消化的抵抗力的最低劑量,350μm也被認為是角膜膠原交聯術的角膜安全厚度[24]。

經典角膜膠原交聯術的適應證為去除角膜上皮后角膜厚度大于400μm，源于紫外線照射對角膜內皮的損傷，但是在臨床上很多圓錐角膜及LASIK術后角膜膨隆患者的角膜厚度達不到這一要求。為避免這種限制，Hafezi等[25]針對薄角膜患者提出另一種替代治療方案，即低滲核黃素溶液配合UVA照射治療。使用低滲核黃素溶液可使角膜厚度增加到400μm，可治療角膜最小基質厚度為320μm[26-27]，因此在核黃素-UVA處理之前應對角膜厚度進行測量，以確定不適合的病例。

分界線表示淺層交聯區與深層未交聯區的界限，代表圓錐角膜CXL治療中的有效深度，這可以作為觀測交聯深度的重要指標之一。在經典交聯治療后最早2wk左右，可以發現在角膜300μm處出現一條分界線，在裂隙燈處或使用前段光學相干斷層掃描(AS-OCT)檢測角膜基質分界線，其在交聯后的前3mo最明顯。Caporossi等[28]對人眼交聯術后進行了共聚焦顯微鏡觀察，通過識別270～330μm深度的明顯垂直和橫向過渡區域，檢測到有效治療深度，在分界線之前觀察到角質形成細胞凋亡。發現前基質層(手術治療區域)表現為僅有少量角膜細胞核和水腫反射率，而后基質層(未治療區域)顯示常規角膜細胞群和正常反射率。治療后基質的角質細胞再增殖于術后1mo開始，并于術后6mo結束，術后6mo角膜內皮顯示出規則的形態。蘇云娟等[29]在對CXL術后患者角膜微結構變化的觀察中發現，術后12mo基質細胞數量幾乎恢復至術前水平，術后角膜基質層后部細胞和內皮細胞的大小及形態未受影響。

基質線的深度取決于核黃素溶液的濃度和UVA的強度。已有文獻指出，根據擴散梯度，核黃素濃度隨著角膜深度的增加而呈線性下降[30]。在基質前部濃度最高，施用核黃素30min后濃度達到動態平衡，并在深層基質中呈線性降低[31]。CXL效應主要取決于UVA照射的強度，在較小程度上取決于核黃素的濃度，65%的UVA在角膜基質前200μm內被吸收，所以在角膜基質前200～250μm中硬化效果最大[32]。

Gu等[33]觀察了早期薄角膜病變患者施行該術后的角膜并發癥及其變化。術中使用的低滲核黃素溶液是通過生理鹽水稀釋0.5%維生素B2-核黃素-5-磷酸所得。去上皮后采用370nm波長的UVA照射直徑9mm區域內的角膜，能量密度為3.0mW/cm2。低滲核黃素每隔3min施用于角膜，持續30min，以維持核黃素在角膜基質中的飽和度。納入患者6例8眼的數據進行研究分析：術前的平均角膜厚度(MTCT)為408.5±29.0μm，去上皮后MTCT為369.8±24.8μm。施用低滲核黃素后，MTCT增加至445.0±26.5μm，與術前參數相差不大。術后3mo圓錐角膜頂端的平均K值下降，BCVA平均值增加，平均內皮細胞密度(ECD)下降，未發現角膜基質感染及其他并發癥。

有文獻指出，為了保護內皮免受非常高的照射強度，在角膜厚度小于400μm表面上最薄的部位，不去除上皮細胞的跨上皮角膜交聯[34]。但可能導致沒有足量的核黃素滲透入角膜深部，從而不會形成明確的交聯分界線。另有文獻提出，可將核黃素濃度增加至0.2%，使UVA在角膜前基質更加充分地吸收，從而減少對內皮細胞的損傷[18]。

1.4 CXL聯合手術準分子激光上皮瓣下角膜磨鑲術(laserinsitukeratomileusis,LASIK)是目前常用于激光矯正視力的手術方法之一，首先通過飛秒激光或使用角膜板層刀制作一個角膜瓣，掀開后在暴露的角膜基質床上進行準分子激光切削，以達到矯正視力的目的。LASIK術具有精確度高、安全有效等優點，但同時也會存在屈光回退和術后角膜膨隆等并發癥，影響患者視覺質量。因此，有學者提出應用聯合角膜交聯術對LASIK術后角膜膨隆進行治療，旨在延緩角膜膨隆病情進展的同時對患眼進行屈光重建，從而提高患者的視覺質量。

角膜膠原交聯術主要作用于角膜前基質層，即是LASIK術中角膜被切削的部分。已有研究證實，角膜交聯術對于治療LASIK術后角膜膨隆具有肯定的效果[35-36]，聯合治療術后UCVA顯著提高，Kmax值顯著降低，證明了該方法的有效性。在與單純行LASIK術的對照中發現，CXL聯合LASIK手術對于屈光不正的患者具有更好的療效，優于單純LASIK治療組[37]。在對近視患者的預防性治療中，CXL聯合LASIK術可以有效地預防屈光回退和潛在的角膜擴張[36]，且術后角膜內皮細胞數量與術前相比并沒有統計學差異，證明了該手術方法的安全性。但是當前對于聯合手術的研究較少，觀察時間較短，其長期療效與生物力學的評價有待進一步的研究。

2 總結及展望

角膜膠原交聯術經典方法耗時較長，可能存在角膜上皮愈合不良、感染等術后并發癥，近年來已有多項研究對經典方式進行了改良。

加速交聯法可取得與經典去上皮法相同的治療深度，但總照射劑量的個性化選擇以及照射能量和照射時間的優化匹配，以及在安全性和有效性上還需要進一步的長期觀察。為了提高核黃素的浸潤效率以及加快核黃素的浸潤時間，各種促滲劑及促滲方法的運用實現了保留角膜上皮的跨上皮角膜膠原交聯，但是目前其改變角膜生物力學的效果與經典去上皮角膜膠原交聯還有一定的差距，并不作為圓錐角膜的常規治療方案。該治療方法使角膜細胞的損傷位于角膜前200μm基質，減少了去上皮所致的術后并發癥，如何提高交聯的療效對于跨上皮角膜交聯還需要長期進一步改良和優化。對角膜厚度薄于400μm的圓錐角膜患者多采用低滲核黃素配合UVA治療，如何進行有效的角膜角膜交聯，既保護好內皮細胞，又能增強角膜的生物力學，延緩圓錐角膜的病情，為將來驗配RGP或選擇深板層角膜移植提供有力的支撐，也是角膜膠原交聯改良術式未來發展的趨勢。CXL聯合LASIK手術治療可以有效預防單純LASIK術后出現的角膜擴張和屈光回退等并發癥，為角膜交聯手術與其他手術方式的聯合應用提供了新的治療思路。