羊痘病毒研究綜述

黃學圣，陳軼霞，趙詩佳，宴銘英，龔璟暉

（西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

羊痘病是養羊業中較為常見的疾病，該病流行范圍廣，每年各地區時有發生，以春、秋兩季流行最為多見。羊痘病毒是導致羊群出現羊痘病的病因，羊痘病毒會導致綿羊感染出現綿羊痘（Variola caprina；Sheep pox；SPV），山羊感染出現山羊痘（Variola caprina； Goat pox；GPV），是一種感染性很強的急性傳染病，可通過接觸進行病毒的傳播。羊群感染該疾病時，皮膚、黏膜處會出現大量的丘疹、結痂、水皰，嚴重威脅羊群的生長發育[1]。動物痘病中羊痘病毒是危害最大也是最危險的一種，感染羊痘病毒的羊群將會給當地畜牧業造成嚴重的經濟損失[2]。不同的菌株在感染羊群后所表現出的毒力不同，有的毒株致死率為10%～58%或達到75%～100%。在易感的羊群中，可以導致剛出生不久的小羊的病死率高達100%，而在妊娠中的母羊則極易發生流產[3]。

1 病原分類及形態特征

1.1 病原的分類

羊痘病毒屬于痘病毒科，脊索動物痘病毒亞科，羊痘病毒屬。其中包含兩種具體的病毒，一是綿羊痘病毒，簡稱為SPPV，二是山羊痘病毒，簡稱為GTPV。分析羊痘病毒的遺傳物質，能夠得到的結果是，DNA為該病毒的遺傳物質，并且是線性雙股的，特別之處在于，在具有相同類型的病毒中，可以在細胞質中復制，而且在結構上有囊膜，長度在150 kb左右[4]。

1.2 形態特征

使用電子顯微鏡，可以看到羊痘病毒的具體形態，在病毒發展的初期階段，大多是卵圓形的，大小一般在 250～350 nm；成熟后的羊痘病毒在電子顯微鏡下觀察，也多呈現為卵圓形，大小約為（150～180）nm×（150～180）nm[5]。當病毒已經進入到宿主細胞中時，宿主細胞也一般是橢圓形的，且會產生胞漿包涵體。觀察外層的病毒粒子的結構可以發現，其外層是管狀形的，在其脂蛋白膜外面，有兩個啞鈴形狀的核酸芯髓[6]。該病毒的核酸是由雙股DNA組成的，分子質量在（130×106）ku～（240×106）ku左右。

1.3 傳播途徑

羊痘病毒傳染性強，無論是哪種年齡階段以及品種的羊都是該病毒的寄主。羊群一般都為集中飼養，羊舍擁擠，感染的羊與健康的羊接觸密切，導致該病傳播率高，爆發迅速。羊痘病毒在痂皮內也可存活很久，不慎接觸的羊也會感染該病毒。但該病主要由呼吸道感染傳播，或由近距離接觸感染動物、或間接傳染。病毒可通過體液、皮膚及黏膜傷口進入動物體內，蚊蟲叮咬也會導致該病毒傳播[7]。

2 臨床癥狀

羊在感染羊痘病毒后有一段時間的潛伏期，一般情況下潛伏的時間為6～8 d，山羊痘病的感染潛伏期為5～10 d。羊感染病毒后最先表現為精神萎靡，呼吸不暢，食欲不振，呼吸短促等，伴有流涕、結膜充血、眼瞼腫脹、體溫升高等癥狀[8]。羊的皮膚黏膜上出現痘疹是羊痘病臨床上最典型的病變癥狀。受到該病毒感染的羊，一般會在鼻子、眼睛、尾根和乳房等部位出現痘疹。痘疹初始為紅斑，隨后迅速形成直徑3～5 mm的硬圓丘疹。丘疹經5 d左右會形成水泡，水泡經過2～4 d變成膿包，膿包持續2 d左右會干燥結痂脫落。

3 病原分子的生物學特性

SPPV與GPPV同屬的病毒的基因都是在150 kb左右，具有很高的同源性，并且，對于二者的核苷酸進行研究之后就會發現，大約96%的序列都是一致。在CPV基因組中，在其中間含中間編碼區，與其他痘病毒的結構是一致的，并且還具有反向末端重復序列（Inverted terminal repeat，ITR），且兩端的序列是相同的。在GTPV和SPPV基因組中，可以發現二者都存在147個開放閱讀框（ORF），可以進行編碼的蛋白的數目很廣泛，一般是可以對53～2 027個氨基酸進行編碼，編碼密度為93%。對于這類的病毒的基因組中間的區域（ORFs024～123）與編碼病毒復制所需蛋白質的其他痘病毒進行比對之后，發現它們具有同源的保守序列。其在病毒的復制中主要是擔任病毒的轉錄、DNA 的復制與修復RNA的作用，此外，也可以進行成熟病毒粒子的胞內組裝。在該基因序列的兩端，一端是ORFs001～023，另一端是ORFs124～147，包括一個有8個基因的基因家族，以及與逃避宿主的免疫識別和反應的一些基因，主要是在編碼表皮生長因子樣蛋白（EGF-like protein）、絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpin）、胞質分裂絲蛋白、PKR 阻遏蛋白、白細胞介素-10（IL-10）等起作用，并且，該基因序列還可以對宿主進行一定的選擇且有一定的致病性，這些是痘病毒所特有的。在該病毒基因組的尾端，存在一個類似發夾的環形結構，經過測定，其大約有75%的（A+T），發夾結構以及末端重復序列至少有200 bp[9]。雖然，GTPV與SPPV具有很高的同源性，但是在基因組末端的某些毒力基因和宿主嗜性功能基因上存在一定程度的序列差異。這些差異主要存在于基因組兩端和推測具有毒力和宿主范圍功能的基因當中。如對于二者的末端的 ITRs就存在很大的差異，GTPV為2 198 bp，SPPV為2 213～2 349 bp；二者的串聯重復序列也有一定的差異，在距離末端（ORF001和ORF147）的區域最近的地方，SPPV有46 bp的ORFs，但GTPV卻并不表達這一末端重復序列。

4 診斷方法

根據臨床表現特征和流行病學癥狀觀察，就可以判斷羊是否感染上該類病毒。但若有非典型病例出現，則需要在實驗室中用分子學或血清學等方法才能確診。羊痘病毒的診斷方法常用的有ELISA方法、PCR鑒定法、電鏡觀察法、血凝試驗、瓊脂擴散實驗、細胞中和試驗。

利用PCR序列擴增的方式可以很快地得到大量從活組織中取出的SPPV的DNA片段。Ireland D C[10]利用SPPV基因組的融合蛋白和P32蛋白設計出特定的引物，能特異性擴增出SPPV，然后，基于限制性內切酶EcoRⅠ和DraⅠ特殊的識別位點，從而來對PCR產物進行驗證分析。Balinsky等建立了實時PCR方法，該方法只需2 h就能從血清層、鼻拭子、口腔拭子和皮膚病灶處檢測出病毒[11]。

另外，臨床有的還使用血清學的診斷方法，比如說，間接免疫熒光實驗、ELISA、瓊脂擴散實驗（AGID）等。但是使用該方式時需要注意抗體交叉反應的問題。由于副痘病毒和羊痘病毒的血清型極為類似，從而會導致對來自牛、綿羊、山羊病毒毒株的混淆。最近，在Western Blot免疫印跡實驗的基礎上，對羊痘病毒的P32抗原和待檢血清進行檢驗，效果較好。Carn V M等[12]在克隆P32基因之后，并將該基因移植在大腸埃希菌中，最終將該基因以融合蛋白的形式進行表達，此后，基于上述產生的重組抗原，成功建立起新型的ELISA診斷試劑盒，可以用于單克隆抗體的生產。新試劑的出現使得ELISA特異性得以不斷提高。

5 免疫與疫苗

痘病毒可以對很多的免疫基因進行重新編碼，從而使宿主免疫反應不起作用或作用較弱。Abu-El-Saad等使用成年瑞士小白鼠實驗，對小白鼠進行SPPV滅活苗或減毒苗接種，結果發現接種疫苗12 h后疫苗注射部位的巨噬細胞功能降低，有利于病毒的入侵。機體在被SPPV感染后，T細胞激活并分泌細胞因子很可能需要5 d時間[13]；SPPV如何入侵并逃避宿主免疫反應，其能力并不是依賴于病毒的感染力，而是病毒入侵之后，改變脾臟的巨噬細胞和淋巴細胞的活性，使得巨噬細胞和淋巴細胞的代償性增強，從而讓宿主免于受到局部免疫抑制而造成的致命后果[14，15]。

在預防羊感染這類病毒方面，可以使用滅活疫苗或者弱毒疫苗，但是使用前者的效果不好，一般不使用，因為只能實現較短時間的免疫。制備羊痘病毒活疫苗時可以使用致弱后的病毒毒株，雖然降低了病毒的活性，但是進行接種之后，還是會有較強的免疫反應。其缺點在于，即使接種了弱毒疫苗，還是會導致羊產生痘疹反應，如果情況嚴重，甚至引起死亡[16]。

被羊痘病毒感染后恢復健康的羊會產生終身免疫力，使羊不會再患上其余的羊痘病毒[17]。目前，研制出更高效更準確的基因工程疫苗一直是研究人員的目標。由于CPV的基因組比一般的病的要大得多，這也增加了外來基因進行表達的能力。利用這一點，可用在GTPV的非編碼區中把插入外來基因，這樣做的好處在于不會對其自身的復制產生影響，也對其抗原性無影響，因此，可以利用這個優勢，生產重組疫苗。如將牛瘟病毒（Rinderpest virus）、小反芻獸疫病毒（Pestedes pttits ruminants virus，PPRV）基因在羊痘病毒載體中進行表達，基于這個產出的重組單一疫苗，對牛瘟、羊痘、小反芻獸疫都會有不錯的效果[18，20]。

在發現羊痘病毒P32蛋白的免疫原性等對羊痘病毒有很好的防治作用后，P32蛋白仍是近幾年來防治羊痘病的研究熱點，其在預防CPV感染中也有重要作用[21]。因為P32蛋白免疫原性很強大，所以能通過誘導之后產生中和抗體，但由于P32蛋白表達量低且不穩定，關于P32蛋白的應用方法還有待進行更多的研究[22]。

如今生命科學領域的技術正蓬勃發展創新不斷，很多研究學者都對羊痘病毒作為活載體疫苗的研究做出了巨大的貢獻。Berhe等[23]人就通過生物科技手段，成功實現了小反芻獸疫病毒F基因的重組羊痘病毒的構建。Aspdcn等[24]也在狂犬病病毒糖蛋白的重組羊痘病毒中取得了巨大的突破。

6 展望

防治羊痘病毒對羊的侵害應該以預防為主，治療為輔。近年來，畜牧業遭受羊痘病毒感染而造成經濟損失的報道仍有發生，研究出快速、準確、有效的檢測和預防方法勢在必行。畜牧業在我國經濟發展中起著重要推動作用，但我國對于SPV和GPV的研究仍落后于歐洲等發達國家。雖然實驗室中已有用于診斷羊痘病毒的分子和血清學方法，但市場上，質量不同的診斷試劑盒對診斷結果的準確性仍存在較大的誤差，因此，預防羊痘病也存在困難。

在生命科學的分子生物學領域快速發展的今天，普通民眾也逐漸加深了對基因的認知，人們對基因的研究也更加深入，期望以更了解病菌致病的機制以用于防疫。目前，研究人員對羊痘病毒的免疫和致病機制的研究較少，必須加強對羊痘病毒基因組特性的研究，才能很好地對羊痘病進行預防和治療，尤其是對P32蛋白、活載體疫苗的認識要更為全面。