當歸補血湯干預肺纖維化大鼠氣虛血瘀狀態機制初探

王杰鵬，王少賢，方朝義，王 浩，方 芳，魯辰希，劉 娜

肺纖維化(PF)是一種以慢性炎癥和大量膠原纖維沉積為病理特點的肺間質疾病[1]，其發病原因和機制未明，且發病率和病死率逐年上升[2]。目前，該病尚缺乏特效藥物，雖然尼達尼布和吡非尼酮可在一定程度上緩解患者臨床癥狀，但其嚴重的不良反應和昂貴的價格限制了臨床應用[3-4]。中醫藥在治療PF中有著重要作用，不但能夠緩解臨床癥狀，還可改善患者服用激素和免疫抑制劑后出現的不良反應，有著廣泛的應用前景，日益受到國內外學者的重視[5]。中醫學認為，PF發病主要責之于肺氣本虛，氣虛無力運行血液而致瘀，故益氣活血為PF的基本治法[6]。臨床研究證實，PF患者不僅存在氣虛證表現(如動則喘息氣短)，也存在血瘀證表現(如口唇、爪甲紫紺等)[7]，而且患者血液呈現高血凝和高黏滯特點[8-9]。當歸補血湯是益氣活血的代表方，但其調節PF大鼠氣虛血瘀狀態的機制尚未明確。據此，本研究通過當歸補血湯干預PF大鼠，觀察大鼠體質量、負重游泳時間、血液流變學及氣虛血瘀證候量化評分的變化，初步探討當歸補血湯干預PF大鼠氣虛血瘀狀態的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠90只，體質量180～200 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證編號：SCXK(京)2016-0006，飼養于清潔級動物房。

1.2實驗試劑與儀器 注射用鹽酸博萊霉素(日本化藥株式會社，批號：970592)。黃芪、當歸中藥飲片由北京同仁堂有限責任公司提供。全自動血液流變儀(北京普利生儀器有限公司，型號：LBY-N75008)，組織包埋機(德國徠卡，型號：EG11508)，全自動輪轉式切片機(德國徠卡，型號：RM2255)，攤片機(德國徠卡，型號：HI1210)，光學顯微鏡(日本奧林巴斯，型號：BX53)。

1.3方法

1.3.1造模與分組給藥：90只SD大鼠適應性飼養1周后，稱重，根據體質量編號，隨機分為假手術組、模型組和當歸補血湯組，每組30只。依據文獻[10]的方法，模型組和當歸補血湯組采用氣管內滴注鹽酸博萊霉素制備PF大鼠模型。手術后第2天起灌胃治療，假手術組和模型組予以生理鹽水10 ml/(kg·d)灌胃，當歸補血湯組灌胃當歸補血湯(由黃芪30 g、當歸6 g組成)中藥煎液3.75 g/(kg·d)。

1.3.2標本采集：分別于灌胃治療后第7、14和28天分3次以2%戊巴比妥鈉(4 mg/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，每次10只，斷頭取血、取肺，左肺組織置于預冷生理鹽水中快速沖洗，剪取大小為1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm的組織塊，置入4%多聚甲醛溶液中固定。采集血標本2 ml置于提前加入0.1 ml EDTA的采血管中。

1.3.3大鼠體質量變化：于手術前1 d每組隨機選取10只大鼠稱取大鼠體質量，作為第0天體質量。分別于灌胃后第7、14和28天分別稱取10只大鼠體質量，觀察體質量變化。

1.3.4大鼠肺組織病理形態學觀察：取第28天時以4%多聚甲醛固定的肺組織，經脫水、透明后進行石蠟包埋，自動切片機切取厚度為0.4 μm的組織切片，行HE染色和Masson染色，觀察大鼠肺組織炎癥浸潤和膠原沉積情況。

1.3.5大鼠負重游泳時間測定：分別于實驗第7、14和28天將大鼠置于水箱中游泳，水溫25℃，尾部負重相當于體質量10%的鉛皮，游泳直至力竭(頭頂沒入水面，沉入水中8 s不能浮起)，記錄時間。

1.3.6血液流變學檢測：取抗凝的全血標本，置于全自動血液流變儀檢測大鼠全血黏度(低切、中切和高切)變化。

1.3.7大鼠氣虛血瘀證候量化評分：依據文獻[11-12]，參照2002年出版《中藥新藥臨床指導原則(試行)》中血瘀證部分和氣虛證部分的癥狀分級量化評分表，對大鼠進行氣虛血瘀證候量化評分。評分表見表1。

表1 大鼠氣虛血瘀證候量化評分表

2 結果

2.1大鼠體質量變化情況 3組在第0天的體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)。與假手術組比較，模型組在第7、14和28天的體質量顯著下降(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，當歸補血湯組在第14和28天的體質量顯著升高(P<0.05)。當歸補血湯組在第7天的體質量雖有升高，但與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.2大鼠肺組織病理形態學改變 HE染色和Masson染色結果顯示，假手術組大鼠的肺組織結構完整，無炎性細胞浸潤，無纖維細胞增殖。模型組大鼠的肺組織肺間質融合，結構破壞，伴大量膠原及成纖維細胞沉積。表明PF大鼠模型造模成功。見圖1和圖2。

表2 3組大鼠的體質量變化情況

注：與假手術組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05

圖1 假手術組和模型組肺組織的HE染色結果(HE ×20)

圖2 假手術組和模型組肺組織的Masson染色結果(Masson ×20)

2.3大鼠負重游泳時間比較 與假手術組比較，模型組在第7、14和28天的負重游泳時間均顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，當歸補血湯組在第7、14和28天的負重游泳時間均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 3組大鼠的負重游泳時間比較

注：與假手術組比較，bP<0.01；與模型組比較，aP<0.05，dP<0.01

2.4大鼠血液流變學指標比較 與假手術組比較，模型組大鼠在第7、14和28天的全血黏度(低切、中切和高切)均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，當歸補血湯組在第7、14和28天的全血黏度(低切、中切和高切)均顯著下降(P<0.05或P<0.01)。見表4。

2.5大鼠氣虛血瘀證候量化評分比較 與假手術組比較，模型組在第7、14和28天的氣虛血瘀證候量化評分顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，當歸補血湯組在第7、14和28天的虛血瘀證候量化評分顯著下降(P<0.05或P<0.01)。見表5。

3 討論

有相關研究顯示，氣虛血瘀是PF常見的證候特征，益氣活血是該病的基本治法[13]。對于其形成機制，李麗娜等[14]從氣血角度進行了闡述，認為氣血本出一源，其形成和運行均與肺有密切的關系。在PF狀態下，機體的免疫失衡與肺氣虛證的免疫系統變化一致。另外，肺毛細血管出現廣泛狹窄和(或)閉塞、微血栓形成導致循環阻力增加、微循環速度降低等表現符合中醫血瘀證的微觀表現，使組織細胞無法從血液中獲得營養物質(如葡萄糖、氨基酸等)。炎性細胞浸潤和膠原沉積是PF形成的重要病理改變。本研究結果顯示，PF模型大鼠肺組織存在大量炎性細胞浸潤和成纖維細胞增殖，肺間質增厚。以上病理改變致使肺部氣體交換受阻，細胞處于缺氧狀態。缺氧和葡萄糖缺乏導致細胞能量代謝障礙，影響支氣管肺泡干細胞的功能，致使肺組織修復障礙，血管新生水平降低，血管退化，符合氣虛血瘀證的變化情況[15-17]。

表4 3組大鼠血液流變學指標比較

注：與假手術組比較，bP<0.01；與模型組比較，aP<0.05，dP<0.01

表5 3組大鼠氣虛血瘀證候量化評分比較分)

注：與假手術組比較，bP<0.01；與模型組比較，aP<0.05，dP<0.01

游泳力竭時間是反映運動耐力的重要指標[18]，機體在氣虛狀態下存在耐力下降的表現，故負重游泳實驗可用于評價機體的氣虛狀態[19]。血液流變學指標可反映血液及其有形成分的流動性、變形性和聚集性變化。低切變率下的全血黏度反映紅細胞聚集性，低切黏度高，紅細胞聚集性高；高切變率下全血黏度反映紅細胞變形性，高切黏度高，則紅細胞變形能力或彈性差[20]。本研究結果提示，PF大鼠負重游泳時間較假手術組顯著下降，全血黏度(中切、低切和高切)較假手術組顯著升高。表明PF大鼠存在氣虛狀態，且紅細胞聚集性升高，變形能力或彈性變差，導致血液黏度升高。究其原因，一方面可能是氣虛無力推動血液運行，而致血液凝滯，出現高凝狀態；另一方面可能是瘀血阻滯肺絡，肺失宣降，與外界氣體交換受阻，導致機體能量代謝障礙，加重了氣虛狀態。

根據上述，益氣活血法是臨床上治療PF的基本方法。當歸補血湯源自《內外傷辨惑論》，由黃芪和當歸以5∶1的比例組成，具有益氣活血之功效。有實驗研究顯示，當歸補血湯可改善纖維化肺臟局部免疫環境，并能改善PF小鼠的肺毛細血管瘀血狀況[14]。本研究結果提示，當歸補血湯可提高PF大鼠負重游泳時間和體質量，下調大鼠紅細胞聚集性，改善其變形能力和彈性，從而減輕大鼠肺組織肺絡瘀阻的現象。其機制可能是通過補益肺氣，進而推動血液運行，延緩或減輕肺絡瘀血，增加機體與外界氣體的交換，改善缺氧和葡萄糖缺乏導致的細胞能量代謝障礙，促進肺組織局部微環境的修復，從而通過益氣活血作用影響PF病理進程，緩解其氣虛血瘀狀態。

綜上所述，氣虛血瘀是PF疾病過程的基本病機，當歸補血湯能夠提高PF大鼠耐力，下調全血黏度，并降低氣虛血瘀證候量化評分，但其具體機制尚待深入研究。