RNA干擾免疫蛋白酶體對缺血性腦卒中大鼠梗死面積及炎性反應的影響

王 丹

缺血性腦卒中主要是由于頸動脈、椎動脈狹窄或閉塞所致腦供血不足，最終引起腦組織壞死的疾病[1]。在臨床上對缺血性腦卒中的治療旨在阻止腦缺血發展，減輕腦損傷，根據患者不同病因、病情等制定治療方案，進行個體化治療。目前，在臨床上沒有治療腦卒中的特效藥物，多數患者需要長期用藥治療與護理，故腦卒中發病機制研究對臨床治療具有重要意義[2]。泛素-蛋白酶體系統是真核細胞體內蛋白質降解體系，能夠清除受損蛋白以及錯誤折疊蛋白，調節細胞內蛋白水平，維持細胞內環境穩態平衡，同時也參與細胞周期、凋亡、翻譯、轉錄、免疫應答等多種細胞生理進程[3]。低分子量多肽2(LMP2)是免疫蛋白酶體20S的β亞單位，能夠促進蛋白酶體產生，增強與組織相容性抗原結合多肽的能力，還能夠促進淋巴細胞存活[4]。有實驗研究發現，LMP2沉默可以改善腦缺血大鼠血腦屏障的通透性[5]。本研究通過RNA干擾技術下調LMP2表達，發現RNA干擾LMP2預處理可以改善缺血性腦卒中大鼠的腦梗死情況與炎性反應。具體內容報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗試劑與儀器 兔抗鼠Caspase-3抗體(9662P，上海北諾生物科技有限公司)，兔抗鼠腦源性生長因子(BDNF)、酪氨酸激酶受體B(TrkB)、核因子-κB(NF-κB)p65抗體(上海恒斐生物科技有限公司)，TUNEL試劑盒(KGA702C，上海優予生物科技有限公司)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(K4754-100，艾美捷科技有限公司)、白介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(YM-QP10189，上海遠慕生物科技有限公司)，RNA干擾病毒載體LMP2-shRNA及NC-shRNA(上海吉凱基因化學技術有限公司構建及鑒定)。電凝器(200B，四川科儀誠科技有限公司)，正置熒光顯微鏡(DFM-20C，上海蔡康光學儀器有限公司)，全自動輪盤式切片機(KD-2258，北京佳源興業科技有限公司)。

1.2實驗動物 選取SPF級健康雄性4周齡SD大鼠44只，體重為240～260 g，購于南方醫科大學，許可證號：SCXK(粵)2016-0041。購回適應飼養1周，飼養環境溫度為20～25℃，濕度為50%～55%，人工光照12 h，自由飲水。在本實驗中對動物的處置均嚴格遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定。

1.3實驗分組與模型制備 采用線栓法制備缺血性腦卒中大鼠模型，手術前禁食12 h。將SD大鼠分為假手術組12只、模型組16只以及RNA干擾組16只，將模型組和RNA干擾組大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉3 ml/kg進行麻醉，麻醉成功后消毒，切皮鈍性分離左側頸總動脈、翼腭動脈、頸內動脈、頸外動脈，結扎翼腭動脈，在距離頸總動脈分叉10 mm處結扎頸外動脈，采用電凝器灼斷頸外動脈遠心端，采用尾靜脈夾夾閉左側頸總動脈，于結扎頸外動脈距離近心端5 mm處，剪一切口，頸外動脈近心端、頸內動脈牽拉為直線。將生理鹽水預處理過的線栓由左側頸外動脈主干切口向頸內動脈入顱方向緩慢插入，當距分叉口18～20 mm時，有輕微阻力，表示線栓處于大鼠大腦中動脈且大腦中動脈已阻斷，固定線栓，阻斷2 h后再灌注，將線栓回抽至頸動脈分叉處，常規縫合傷口。假手術大鼠操作只進行至分離動脈，不進行結扎和凝閉、不插線栓，傷口縫合等方式與模型組和RNA干擾組相同。造模成功標準：大鼠反應遲鈍，行走出現向右轉圈或者傾斜，倒懸空時右側上肢屈曲。模型組和RNA干擾組造模過程中各死亡2只，另外模型組造模不成功2只，RNA干擾組造模不成功1只。

1.4干預方法 于造模前1 h，采用微量進樣器將10 μl NC-shRNA、10μl LMP2-shRNA慢病毒載體分別注入模型組和RNA干擾組大鼠側腦室內，定位方法參考文獻[6]。于術后、再灌注12、24和48 h時分別進行神經功能評分、炎性因子水平檢測。各組分別于再灌注48 h時，麻醉處死大鼠，取出腦組織，用于觀察腦組織梗死情況，其中一部分腦組織用于炎性因子檢測、TUNEL檢測，另一部分腦組織存儲于-80℃環境待測。

1.5神經功能評分 采用Longa的5級評分法對各組術后、再灌注12、24和48 h的神經功能進行評定。無神經缺損癥狀記0分，不能伸展右側前爪記1分，行走時向右側轉圈記2分，行走時向右側傾倒記3分，不能自發行走、意識喪失則記4分。

1.6TNF-α、IL-1β含量檢測 取各組術后、再灌注12、24和48 h時的靜脈血各1 ml，1500 r/min離心10 min，取上層血清存儲于-80℃冰箱，采用ELISA法檢測血液中TNF-α、IL-1β水平。待各組再灌注48 h靜脈采血后，麻醉處死大鼠，將腦組織加入組織細胞裂解液與蛋白酶抑制劑，研磨成勻漿，3000 r/min離心20 min，取上層清，用于腦組織TNF-α、IL-1β含量的ELISA檢測。所有實驗操作嚴格參照試劑盒說明進行。

1.7腦梗死情況檢測 各組再灌注48 h后，取出完整腦組織，于-20℃冰箱中速凍15 min，專用腦槽進行冠狀切片層厚2 mm，再將腦片置于2%TTC溶液中，37℃恒溫水浴避光25 min，PBS清洗3次，甲醛固定24 h，整理腦片，進行圖像采集。采用Image J軟件對大鼠腦梗死面積進行數據收集。腦組織呈現出紅色表示為正常的腦組織，腦組織呈現出白色為腦梗死組織，腦梗死體積(mm3)=各層面梗死面積總和×各層厚度，腦梗死體積百分比=腦梗死體積/半球總體積×100%。

1.8TUNEL檢測 將腦組織置于4%多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋切片，采用TUNEL法觀察腦組織細胞凋亡情況，實驗步驟嚴格按照TUNEL試劑盒說明書操作，在顯微鏡下觀察并采集圖像。隨機選取5個視野，記錄每個視野100個細胞中的陽性細胞數，計算5個視野的陽性細胞數均值作為該組的陽性細胞數。

1.9Western-blot檢測 提取各組大鼠腦組織總蛋白，采用Bradford調節蛋白濃度、SDS-PAGE電泳、電轉至PVDF膜，密封2 h，加入BDNF、TrkB、NF-κB p65、GAPDH一抗(1∶500)4℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶500)孵育1 h，按照ECL試劑盒操作說明進行顯影，收集影像。

2 結果

2.1神經功能評分比較 采用Longa評分法對各組術后、再灌注12、24和48 h的神經功能進行評定。結果顯示，在相同時間點時，模型組和RNA干擾組的神經功能評分均高于假手術組，模型組在再灌注12、24和48 h的神經功能評分高于RNA干擾組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠的神經功能評分比較分)

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05

2.2血液炎性因子水平比較 采用ELISA法檢測各組大鼠術后、再灌注12、24和48 h血液TNF-α、IL-1β含量。結果顯示，在相同時間點時，模型組和RNA干擾組血液TNF-α、IL-1β含量均高于假手術組，模型組在再灌注12、24和48 h時血液TNF-α、IL-1β含量高于RNA干擾組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2和3。

表2 3組大鼠血液TNF-α水平比較

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α；與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05

表3 3組大鼠血液IL-1β水平比較

注：IL-1β為白介素-1β；與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05

2.3腦組織炎性因子水平比較 大鼠再灌注48 h后，麻醉處死大鼠，取腦組織制備成勻漿，離心取上清，ELISA法檢測3組腦組織TNF-α、IL-1β水平。結果顯示，模型組和RNA干擾組腦組織TNF-α、IL-1β含量均高于假手術組，模型組腦組織TNF-α、IL-1β含量高于RNA干擾組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

2.4大鼠腦梗死情況比較 待3組再灌注48 h后，麻醉處死大鼠，取出完整腦組織，TTC法檢測各組腦梗死情況，TUNEL法檢測各組腦組織細胞凋亡情況。結果顯示，模型組和RNA干擾組腦梗死體積百分比、陽性細胞數均高于假手術組，模型組腦梗死體積百分比、陽性細胞數高于RNA干擾組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1和表5。

表4 3組大鼠腦組織TNF-α和IL-1β水平比較

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白介素-1β；與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05

圖1 腦組織凋亡細胞的TUNEL檢測結果(bar=50 μm)

表5 3組大鼠腦梗死體積百分比和陽性細胞數目比較

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05

2.5腦組織BDNF、TrkB、NF-κB p65、Caspase-3水平比較 采用Western-blot檢測再灌注48 h后腦組織中BDNF、TrkB、NF-κB p65、Caspase-3水平。結果顯示，與假手術組比較，模型組和RNA干擾組腦組織中BDNF、TrkB含量降低，NF-κB p65、Caspase-3水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，RNA干擾組BDNF、TrkB含量升高，NF-κB p65、Caspase-3水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2和表6。

圖2 3組大鼠腦組織BDNF、Trk B、NF-κB p65、Caspase-3凝膠成像結果

1為假手術組，2為模型組，3為RNA干擾組；BDNF為腦源性生長因子，TrkB為酪氨酸激酶受體B，NF-κB為核因子-κB

表6 3組大鼠腦組織BDNF、TrkB、NF-κB p65、Caspase-3水平比較

注：BDNF為腦源性生長因子，TrkB為酪氨酸激酶受體B，NF-κB為核因子-κB；與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05

3 討論

缺血性腦卒中也稱為腦梗死、中風，其發病率高、致殘率高、病死率也高，是嚴重威脅人類生命安全的疾病之一[7-8]。缺血性腦卒中占腦卒中病例數的60%～80%，臨床癥狀多樣，發病機制復雜，導致臨床治療較困難[9]。目前，主要通過制備動物模型，模擬臨床腦卒中患者來對缺血性腦卒中的發病機制進行研究[10]。泛素-蛋白酶體系統主要包括泛素系統和26S蛋白酶體，20S蛋白酶體是26S蛋白酶體的核心結構，LMP2是構成20S蛋白酶體的活性單位之一，具有水解谷氨?；幕钚訹11-12]。已有研究顯示，去泛素酶、小分子抑制劑以及泛素-蛋白酶體降解的蛋白質對缺血性腦血管病均表現出神經保護作用[13-14]。本研究通過線栓法建立缺血性腦卒中大鼠模型，探究RNA干擾LMP2預處理對缺血性腦卒中大鼠腦組織損傷的影響。

本研究結果顯示，RNA干擾組術后神經功能評分顯著低于模型組，表明RNA干擾LMP2預處理可以減輕缺血性腦卒中大鼠神經功能損傷。腦缺血性神經功能損傷主要是由于局部腦組織供血和供氧不足導致的腦損傷，由此推斷RNA干擾LMP2可能降低缺血性腦卒中大鼠的腦損傷。腦梗死直接影響腦功能狀態，本研究結果顯示，當缺血再灌注48 h后，模型組與RNA干擾組均出現腦梗死情況，并且RNA干擾組的腦梗死體積百分比顯著降低，同時TUNEL檢測結果也顯示，RNA干擾組腦組織陽性細胞數目、Caspase-3水平顯著低于模型組。機體缺血缺氧損傷時，線粒體膜結構受到破壞，誘導細胞凋亡因子進入細胞基質，激活Caspase級聯反應并啟動細胞凋亡程序，激活Caspase-3活性，使腦細胞發生凋亡[15]。腦缺血時，蛋白酶體抑制劑可以減輕神經細胞、星形膠質細胞變性，縮小腦皮質梗死體積。而且20S蛋白酶體可以降解特異性蛋白，促進細胞死亡。由此推測，RNA干擾LMP2預處理可以減輕缺血性腦卒中大鼠的腦梗死體積，保護大鼠神經功能，可能與降低缺血腦卒中大鼠腦組織中Caspase-3水平有關。

當發生缺血缺氧時，腦組織中的氧在短時間內消耗完畢，ATP合成出現障礙，影響ATP依賴性蛋白酶體蛋白水解功能，泛素化蛋白累積，引起神經細胞凋亡，發生神經功能障礙[16]。缺血缺氧后會激活機體炎性反應，炎性因子水平增加會增強氧化應激反應，使細胞膜結構破壞，促進細胞凋亡。本研究結果顯示，RNA干擾LMP2預處理可以降低大鼠腦缺血再灌注后血液TNF-α、IL-1β水平以及再灌注48 h后腦組織TNF-α、IL-1β、NF-κB p65水平。TNF-α、IL-1β均參與機體炎性反應，NF-κB是調節炎性反應的重要轉錄因子，含有2個亞基蛋白(p50與p65)，其磷酸化可以使神經元細胞膜NF-κB p65/p50轉錄移位，誘導炎性因子合成增多，放大炎性反應，引起細胞凋亡[17-18]。有學者認為，蛋白酶體可以直接激活NF-κB，介導缺血后自由基氧化損傷，增強組織功能損傷[19]。由此推測，RNA干擾LMP2預處理可以降低缺血性腦卒中大鼠機體炎性反應，可能與影響NF-κB信號通路有關。本研究結果還發現，RNA干擾LMP2預處理可以增加缺血性腦卒中大鼠再灌注48 h后BDNF、TrkB水平。BDNF在腦神經功能修復、功能維持等過程中具有重要作用，TrkB是其特異性受體，BDNF/TrkB磷酸化可以促進神經細胞修復。由此表明，RNA干擾LMP2預處理可以增強缺血性腦卒中大鼠神經功能修復，可能與影響BDNF/TrkB信號途徑有關，但其中具體作用機制，尚不清楚。

綜上所述，RNA干擾LMP2預處理可以降低TNF-α、IL-1β以及NF-κB p65水平，降低機體炎性反應，可能與影響NF-κB信號通路有關；還可以增加BDNF、TrkB水平，降低Caspase-3含量，從而減少腦組織損傷，保護神經功能，可能與影響BDNF/TrkB信號途徑有關，但其中分子作用機制還需要進一步研究。