新型塞來昔布衍生物的合成及其心血管風險的研究

林珊 王澤雨 楊建峰

[摘要] 目的 通過改造塞來昔布結構，降低其心血管副作用。 方法 在塞來昔布-CF3位置進行修飾，合成4種新型衍生物;利用液質、核磁等方法進行表征、確定結構;用角叉菜膠誘導的足腫脹36只Wistar大鼠，按體重隨機分為6組，塞來昔布組（灌胃給予塞來昔布），化合物1、化合物2、化合物3、化合物4組（灌胃給予化合物1～4）（每日給藥劑量為5 mg/kg，藥物分散到0.5 mL羧甲基纖維素鈉水溶液中），對照組（每日給0.5 mL羧甲基纖維素鈉水溶液）。用藥3 d取各組大鼠血清用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法測定環氧合酶-2（COX-2）和炎性因子白細胞介素-6（IL-6）的表達水平，用藥7 d取血漿測定凝血因子的變化。 結果 與塞來昔布組比較，化合物1組COX-2水平變化差異無統計學意義（P > 0.05），化合物2～4組COX-2水平升高（P < 0.05）;與塞來昔布組比較，化合物1～4組IL-6水平變化差異無統計學意義（P > 0.05）;化合物2～4組凝血時間長于塞來昔布組（P < 0.05）。結論 化合物3和4在抑制炎性因子IL-6方面與塞來昔布相似的作用，但卻對大鼠的凝血時間無明顯的影響。因此，化合物3和4有望成為低心血管風險的塞來昔布衍生候選藥物。

[關鍵詞] 塞來昔布;衍生物;抗炎;凝血;心血管風險

[中圖分類號] R971.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）02（a）-0008-07

[Abstract] Objective To reduce the cardiovascular side effects of Celecoxib by modification structure. Methods Four novel derivatives of Celecoxib were synthesized via substitutions of Celecoxib-CF3 group. The structures were identified and determined by the data of LC-MS and NMR spectrum. A total of 36 Wistar rats with foot swelling induced by carrageen glue were randomly divided into 6 groups according to the weight， Celecoxib group （lavage given Celecoxib）， compounds 1， 2， 3， 4 group （gastric gavage compounds 1-4） （a daily dose of 5 mg/kg， drug dispersed to 0.5 mL carboxymethyl cellulose sodium） ， the control group （0.5 mL daily to sodium carboxy methyl cellulose） aqueous solution. Serum levels of cyclooxygenase-2 （COX-2） and inflammatory factor interleukin-6 （IL-6） were determined by enzyme-linked immunoadsorption assay （ELISA） on 3 days after treatment， and serum levels of clotting factors were determined on 7 days after treatment. Results Compared with Celecoxib group， there was no significant difference in COX-2 levels in the compound 1 group （P > 0.05）， while COX-2 levels in compound 2 to 4 group were increased （P < 0.05）. Compared with the Celecoxib group， there were no significant differences in IL-6 levels in the compounds 1 to 4 group （P > 0.05）. The clotting time of compounds 2 to 4 group was longer than that of celecoxib group （P < 0.05）. Conclusion Compounds 3 and 4 have similar effects to Celecoxib in inhibiting the inflammatory factor IL-6， however there is no significant effect on the clotting time of rats. Therefore， compounds 3 and 4 are expected to be Celecoxib-derived drug candidates with low cardiovascular risk.

[Key words] Celecoxib; Derivatives; Anti-inflammatory; Blood coagulation; Cardiovascular risk

塞來昔布具有鎮痛消炎及癌癥抑制作用[1-8]。但近年發現其在使用中存在心血管病風險[9-13]，原因是塞來昔布特異性抑制環氧合酶-2（COX-2），從而抑制COX-2下游的前列腺素I2（PGI2）的合成，PGI2具有抑制血小板聚集和舒張局部微小血管的作用[14]，因此抑制PGI2會導致血小板聚集，引起血栓的形成，導致心血管病風險[15]。

塞來昔布是具有三環結構的鄰二芳基雜環類化合物，其結構中的磺酰胺基團朝向COX-2特異性口袋，因此對COX-2具有較高的選擇抑制性[16]。本研究是在塞來昔布的磺酰胺基團對位的-CF3位置增加取代基團，通過取代基團的牽引作用，適當調整磺酰胺基團對COX-2的結合力，以期在保持原有抗炎作用的同時，降低心血管風險。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

10周左右SPF級Wistar大鼠（180～200 mg，雌雄不分）由哈爾濱醫科大學（大慶）提供，合格證號：SCXK（吉）-2018-0007;試劑均為分析純，購于上海邁瑞及天津大茂試劑公司，批號見文中;角叉菜膠購于sigma公司;活化部分凝血酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）試劑盒、大鼠COX-2酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購于上海赫果公司;Mouse白細胞介素-6（IL-6） ELISA試劑盒購于博士德公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 化學合成[17]

1.2.1.1 化合物1的合成? 1.24 g對甲基苯甲酸甲酯（批號：A1307024）、15 mL甲基叔丁基醚（MTBE）（批號：C10036450）加入三口瓶中攪拌并加入25%甲醇鈉（批號：FCD00012179）（甲醇配制），攪拌2 min后逐滴加入1.11 g對甲基苯乙酮（15 mL MTBE溶解），95℃攪拌20 h（TLC檢測），蒸除溶劑。加HCl溶解，用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，過濾、蒸除溶劑，冷卻得淡黃色固體（1a）2.09 g，未純化備用。

圓底燒瓶中加1a，加20 mL乙醇，攪拌下加1.55 g對肼基苯磺酰胺鹽酸鹽（4-SAPH，批號：B020086），85℃回流20 h（溥層色譜法檢測），蒸除溶劑。加乙酸乙酯和水萃取，分離有機相，飽和氯化鈉洗滌、無水硫酸鈉干燥，過濾、蒸除溶劑得黃色固體。柱色譜提純（石油醚∶乙酸乙酯=50∶1、30∶1、10∶1、5∶1、3∶1），得淺黃色固體（化合物1），產率為69.5%。見圖1（A）。

1.2.1.2 化合物2的合成? 1.69 g 4-（三氟甲基）苯甲酸甲酯（批號：WZG110711-068N）于三口瓶中加MTBE，攪拌下加25%甲醇鈉，攪拌2 min后逐滴加1.11 g對甲基苯乙酮（批號：C1004635），90℃攪拌20 h，產物處理方法同1a，冷卻得白色固體（2a）2.45 g，未純化備用。

圓底燒瓶中加2a，加20 mL乙醇，再加1.55 g 4-SAPH，80℃回流20 h，產物處理同化合物1，得黃色固體。柱色譜提純（石油醚∶乙酸乙酯=10∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶2），得黃色固體（化合物2），產率為71.5%。見圖1（B）。

1.2.1.3 化合物3的合成? 1.28 g對氯苯乙酮（批號：CJ260001）于三口瓶中加MTBE，攪拌下加25%甲醇鈉，攪拌2 min后逐滴加MTBE溶解的1.24 g對甲基苯甲酸甲酯，85℃攪拌20 h，產物處理同1a，得到粉白色油狀物，冷卻后為粉白色固體（3a）2.39 g，未純化備用。

圓底燒瓶中加3a，加20 mL乙醇，再加1.55 g 4-SAPH，80℃回流20 h，產物處理同化合物1，得黃色固體。柱色譜提純（石油醚∶乙酸乙酯=100∶1、50∶1、30∶1、15∶1），得淺黃色固體（化合物3），產率為68.8%。見圖1（C）。

1.2.1.4 化合物4的合成? 1.28 g對氯苯乙酮于三口瓶中加MTBE，攪拌下加25%甲醇鈉，攪拌2 min后逐滴加1.69 g 4-（三氟甲基）苯甲酸甲酯，90℃攪拌20 h，按1a方法處理，得到深黃色固體（4a）2.58 g，未純化備用。

圓底燒瓶中加4a，加20 mL乙醇，再加3.704 g 4-SAPH，80℃回流20 h，產物處理方法同化合物1，得黃色固體。柱色譜提純（石油醚∶乙酸乙酯=15∶1、10∶1、5∶1、2∶1），得黃色固體（化合物4），產率為67.1%。見圖1（D）。

1.2.2 表征

1.2.2.1 熔點測定? 樣品放入鉗鍋中，于差示掃描量熱儀（HSC-2/3/4，北京恒久）中測熔點。

1.2.2.2 液相-質譜聯用儀分析（LC-MS）? 樣品溶于二甲基亞砜，用液質聯用儀（LCT Premier XE，Waters）測定。

1.2.2.3 核磁表征? 樣品放EP管中，加入氘代二甲亞砜渦旋均勻，放核磁管中待測。

1.2.3 動物實驗

1.2.3.1 炎癥模型動物及給藥? Wistar大鼠在常溫下自由進食和水。24 h后，每只鼠右后足趾皮下注射1%角叉菜膠0.1 mL，觀察24 h，取36只誘導成功的爪水腫炎癥模型鼠，隨機分為6組，塞來昔布組、化合物1組、化合物2組、化合物3組、化合物4組每日分別給相應藥物（5 mg/kg，藥物分散至0.5 mL羥甲基纖維素鈉水溶液中），對照組每日給予0.5%羧甲基纖維素水溶液0.5 mL，連續灌胃給藥3 d。最后1天給藥后分別在0、4、8、12、24 h眼眶取血，10 000 g低溫離心，離心機半徑2 cm，得血清用于COX-2和IL-6測定。繼續灌胃給藥至第7天，心臟取血，分離血漿，用于APTT、PT測定。

1.2.3.2 COX-2和IL-6的測定? 分別取“1.2.3.1”各個時間段眼眶取血得到的血清用ELISA法檢測血清中COX-2[18-19]及IL-6的水平[18]。

1.2.3.3 APTT、PT測定? 半自動血凝儀（HF6000-4，海力孚公司），預溫至37℃，測定“1.2.3.1”步驟中得到的各組心臟血漿的APTT和PT[20-23]。

1.3 統計學方法

用統計軟件 SPSS 22.0對數據進行分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組組間采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結構表征

化合物1：熔點185～190℃;分子量（m/z）：404.14 [M+1]+;1H NMR（DMSO）δ：2.34（3H，s，CH3），2.34（3H，s，CH3），7.12（1H，s，吡唑環CH），7.27（2H，s，NH2），7.85（2H，d，苯環CH），7.83（2H，d，苯環CH），7.51（2H，d，苯環CH），7.46（2H，d，苯環CH），7.22（2H，d，苯環CH），7.22（2H，d，苯環CH）。見圖1。

化合物2：熔點135～140℃;分子量（m/z）：458.11 [M+1]+;1H NMR（DMSO）δ：2.35（3H，d，CH3），7.49（1H，s，吡唑環CH），7.30（2H，s，NH2），7.87（2H，d，苯環CH），7.84（2H，d，苯環CH），7.56（2H，d，苯環CH），7.56（2H，d，苯環CH），8.16（H，d，苯環CH），7.81（H，d，苯環CH），7.24（2H，d，苯環CH）。見圖3。

化合物3：熔點165～170℃;分子量（m/z）：424.08[M+1]+;1H NMR（DMSO）δ：2.34（3H，d，CH3），7.48（1H，s，吡唑環CH），7.22（2H，s，NH2），7.86（2H，d，苯環CH），7.53（2H，d，苯環CH），7.96（H，d，苯環CH），7.83（H，d，苯環CH），7.51（2H，d，苯環CH），7.21（2H，d，苯環CH），7.36（H，d，苯環CH），7.29（H，d，苯環CH）。見圖4。

化合物4：熔點130～135℃;分子量（m/z）：478.05 [M+1]+;1H NMR（DMSO）δ：7.49（1H，s，吡唑環CH），7.38（2H，s，NH2），7.89（2H，d，苯環CH），7.83（2H，d，苯環CH），7.57（2H，d，苯環CH），7.57（2H，d，苯環CH），8.17（H，d，苯環CH），7.98（H，d，苯環CH），7.53（2H，d，苯環CH）。

經分析，塞來昔布和化合物1～4結構。見圖6。

2.2 各用藥組血清COX-2水平比較

利用COX-2標準物作COX-2濃度與吸光度標準曲線（圖7），線性擬合得直線Y = 0.0091X+0.1977（r = 0.999），各組大鼠血清按試劑盒指示處理并測其吸光度，代入方程得相應COX-2表達濃度，在4、8、12、24 h時間點各組與對照組比較，大鼠血清中COX-2水平均降低（P < 0.05）;與塞來昔布組比較，化合物1組COX-2水平差異無統計學意義（P > 0.05），化合物2～4組COX-2水平高于塞來昔布組（P < 0.05）?；衔?～4組和塞來昔布組組內各時間段COX-2水平比較，差異均有統計學意義（P < 0.05），其中各藥物組在24 h時間點時COX-2的水平最低（P < 0.05）。見表1。

2.3 各用藥組炎性因子IL-6水平

化合物1～4組、塞來昔布組與對照組比較，在4～24 h IL-6水平顯著降低（P < 0.05）;但化合物1～4組與塞來昔布組比較，差異無統計意義（P > 0.05）;化合物1～4組和塞來昔布組組內各時間段比較，IL-6水平差異均有統計學意義（均P < 0.05），其中各藥物組在12 h時間點時IL-6的水平最低（P < 0.05）。見表2。

2.4 各用藥組對APTT、PT的影響

塞來昔布組、化合物1～2組APTT和PT明顯短于對照組（P < 0.05），化合物3～4組APTT和PT與對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）;化合物1組與塞來昔布組比較，APTT、PT差異無統計學意義（P > 0.05）;化合物2～4組APTT和PT長于塞來昔布組（P < 0.05）。見表3。

3 討論

塞來昔布是COX-2特異性抑制劑，但在使用中存在心血管風險[24]。本研究對塞來昔布結構進行改造，在磺酰胺基對位取代，以取代基的牽扯力，適當降低對COX-2的抑制作用。實驗結果顯示，-CF3被對氯苯基取代后能適當降低母核塞來昔布對COX-2的抑制作用，可能是對氯苯基與其位置上的氨基酸的作用力比-CF3強。

因COX-2正常情況下不表達，只有在炎癥狀態下高表達，因此動物注射角叉膠制造炎癥模型以用于表征塞來昔布組與衍生物組對炎癥的抑制作用。通過COX-2的表達和IL-6因子測量顯示，化合物2～4對COX-2的抑制較塞來昔布有所降低（P < 0.05），但IL-6炎性因子水平差異無統計學意義（P > 0.05），提示通過衍生化適當降低對COX-2的特異抑制，沒有影響對炎癥的治療作用。

塞來昔布及其衍生物均通過抑制COX-2從而抑制其下游PGI2水平，降低凝血作用，本實驗測定大鼠用藥7 d后APTT和PT的變化情況，發現化合物3、4組對凝血時間影響較塞來昔布組及化合物1組明顯延長（P < 0.05），基本達到對照組的正常凝血時間。提示衍生物3、4雖然也通過COX-2抑制了PGI2的水平，但大大降低了塞來昔布對凝血的影響。

本研究用模擬設計的思路在塞來昔布作用于COX-2特異口袋的磺酰胺基的對位進行苯環和氯苯等基團的取代，得到4個新型塞來昔布衍生物，COX-2及IL-6測試提示，化合物3和4適當降低了對COX-2的抑制，保留了與塞來昔布相似的炎癥抑制作用，但明顯降低了對凝血因子的影響，將凝血時間提高到正常水平?；衔?和4有望成為降低塞來昔布心血管風險的候選化合物。

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（收稿日期：2019-05-23? 本文編輯：劉永巧）