洪湖碘泡蟲SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法的建立及其應用

羅 丹 趙媛莉 劉新華 章晉勇

(1. 中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 農業部淡水養殖病害防治重點實驗室, 淮安中心, 武漢430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

異育銀鯽(Carassius auratus gibelioBloch)具有生長快、食性廣、抗病性強等特點, 是我國主要的鯽養殖品種, 年產量近300×107kg[1]。然而隨著異育銀鯽集約化養殖的發展, 病害問題日益嚴重; 其中黏孢子蟲病對當前異育銀鯽養殖的危害僅次于鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyHV-Ⅱ)引起的“鰓出血”病。黏孢子蟲病可發生于異育銀鯽養殖全過程, 迄今缺乏有效的防控措施, 已成為制約我國異育銀鯽養殖業健康發展的主要瓶頸問題[2]。黏孢子蟲物種多樣性高, 僅寄生于異育銀鯽的就有60余種。當前, 對異育銀鯽養殖產生嚴重危害的有4種[3—6], 其中危害最嚴重的是由洪湖碘泡蟲(Myxobolus honghuensis)引起的“喉孢子蟲病”; 自21世紀初流行于江蘇蘇北異育銀鯽主養區以來, 已傳播至全國大部分異育銀鯽養殖區[3]。該病對異育銀鯽的苗種培育及成魚養殖均造成嚴重危害?；疾◆~主要表現為魚體發黑消瘦、眼球凸出、咽喉部紅腫、鰓絲呈暗紫色、鰓絲及體表黏液增多等癥狀, 大量繁殖的蟲體引起咽部膨大并頂起鰓蓋, 最終導致患病魚進食、呼吸困難。在異育銀鯽主養區江蘇鹽城, 該病的發病季節為每年5—10月, 感染率及死亡率都很高, 最高可達100%。因此, 建立基于洪湖碘泡蟲生物學特征的鯽“喉孢子蟲病”防控手段迫在眉睫。

鑒于黏孢子蟲成熟孢子堅硬的外殼, 針對該階段的藥物防控幾乎不可能實現。盡管洪湖碘泡蟲的全生活史尚未闡明, 但黏孢子蟲的兩宿主發育, 即無脊椎動物(主要為底棲寡毛類)體內的放射孢子蟲發育階段與脊椎動物(主要為魚類)體內發育的黏孢子蟲階段, 已得到學術界普遍認同[7]。前期研究表明,相對于成熟黏孢子, 魚類黏孢子蟲生活史中的其他階段對藥物、環境等更為敏感, 因此, 發展基于非成熟孢子的魚類黏孢子蟲病防控措施更為可行。然而, 目前尚缺乏指導確定包括滅活養殖水體中放射孢子蟲活性、阻斷營養體或前孢子發育階段繼續發育等干預措施實施時機的技術手段。另一方面, 對鯽跨境貿易過程中出現的潛伏感染個體的檢疫、新的養殖系統發病風險的評價及所采取的干預措施的效果評價等都缺乏快速檢測方法。根據病害發生“宿主-環境-病原”三環理論, 養殖系統中一定豐度的病原蓄積是導致病害的爆發必要條件之一, 發展養殖系統中洪湖碘泡蟲全生活史發育階段的定量監測技術是解決上述防控問題的關鍵。

目前, 洪湖碘泡蟲的檢測方法主要有基于顯微鏡檢查成熟孢子的形態學方法、基于抗體-抗原反應的免疫學方法[8,9]、普通PCR法、多重PCR法及巢式PCR法[10,11]等。形態學方法雖然操作簡便, 但是存在檢測滯后、效率低、易于漏檢及不適宜病害的早期診斷等問題。由于黏孢子蟲生活史復雜,且種類繁多, 決定了挖掘適用于早期檢測的特異性抗原的困難, 因此盡管免疫學檢測具有快速且適用于生產實踐的等特點, 但考慮到洪湖碘泡蟲生活史各階段抗原譜變異大且早期階段特異性抗原尚未鑒定, 因此我們認為目前發展黏孢子蟲病的免疫學早期診斷方法存在較大困難[12]。分子檢測由于適用于檢測寄生蟲全生活史階段, 在水產寄生蟲病害檢測領域被廣泛應用。然而現有的針對洪湖碘泡蟲的分子生物學方法只能定性檢測。

SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法具有特異性強、靈敏度高、重復性好、操作簡便、用時短和可自動定量分析等優點, 已被廣泛應用于病原微生物的檢測[13]。因此, 本研究根據洪湖碘泡蟲的ITS基因序列設計了一對特異性引物, 建立了洪湖碘泡蟲的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量檢測方法,其特異性好、靈敏度較常規PCR高1000倍, 且在對養殖系統中的環境樣品進行定量監測的應用中顯示出良好的性能, 可為基層水產病害檢疫部門或大型養殖企業開展鯽“喉孢子蟲病”的苗種檢疫、早期診斷、暴發風險預警、防控干預措施實施時機的確定及干預效果評價提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

洪湖碘泡蟲、多涅茨尾孢蟲(Henneguya doneci)、倪李碘泡蟲(Myxobolus nielii)、普洛寧碘泡蟲(Myxobolus pronini)、吳李碘泡蟲(Myxobolus wulii)蟲體的基因組DNA均為本實驗室保存。3份發病鯽的喉部組織、3份無明顯感染癥狀鯽的喉部組織、3份水樣和3份泥樣樣品均采集自湖北黃岡市蘄春縣八里湖五里墩正大水產(湖北)有限公司周年發生喉孢子蟲病的池塘。

洪湖碘泡蟲各類型樣品的采集與保存方法如下: 發病鯽的喉部組織, 在喉孢子蟲病發病時期, 從池塘中采集3尾患喉孢子蟲病癥狀明顯的鯽, 將鯽的喉部組織取出, 保存于無水酒精中; 無明顯感染癥狀鯽的喉部組織, 在喉孢子蟲病發病時期, 從池塘中采集3尾無明顯感染癥狀的鯽, 將鯽的喉部組織取出, 保存于無水酒精中; 水樣, 在喉孢子蟲病發病時期, 用采水器在距離池塘水層表面的50 cm處收集3份500 mL水體, 用3個洗凈的1 L塑料瓶收集并低溫帶回實驗室, 用0.2 μm濾膜在真空泵上過濾,將濾膜保存于無水酒精中; 泥樣, 在喉孢子蟲病發病時期, 用彼得森采泥器采集池塘表層3份50 g底泥, 用錫箔紙包裹后置于凍存管中, 帶回實驗室于-20℃保存。

1.2 ITS基因克隆及引物設計

由于洪湖碘泡蟲小核糖體RNA(18S)基因序列與吳李碘泡蟲相似性過高(93%以上), 因此我們選擇變異度較大的核糖體間隔區域(ITS)為引物設計靶序列[14]。

分別以洪湖碘泡蟲、多涅茨尾孢蟲、倪李碘泡蟲、普洛寧碘泡蟲、吳李碘泡蟲基因組DNA為模板, 使用黏孢子蟲18S通用上游引物F(18R: 5′-CGT AACAAGGTTTCCGTAG-3′)和28S通用下游引物R(Myxo28S1F: 5′-CACTTCACTCGCAGTTACT-3′)進行常規PCR擴增[15]。PCR擴增體系為: 10×PCR Buffer MIX 12.5 μL, 上游引物F(10 μmol/L) 1 μL,下游引物R(10 μmol/L)1 μL, DNA模板 1 μL, 滅菌ddH2O補加至25 μL; 反應程序為: 94℃預變性5min, 94℃變性50s, 54℃退火50s, 72℃ 2min, 35個循環, 最后72℃延伸10min[15]。

在擴增結束后將擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳, 使用膠回收試劑盒將擴增得到條帶切膠回收,與pMD18-T載體連接并轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞。將轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞成功的菌落純化培養, PCR鑒定篩選得到陽性克隆。分別將陽性克隆菌液送往武漢擎科生物技術有限公司進行測序和序列拼接, 即獲得5種黏孢子蟲的ITS序列。利用Clustal X軟件對5種黏孢子蟲的ITS基因序列進行同源性分析, 根據比對結果確定洪湖碘泡蟲特異的非同源性區段, 利用Primer 5.0設計一對特異性引物, 設計的引物序列如下: 上游引物HH-F: 5′-CCACGTTTGTCAGAGTGATTGC-3′;下游引物HH-R: 5′-GGTCGTATATTCACTGCGAC T- 3′, 擴增產物長度為176 bp。引物由武漢擎科生物技術有限公司合成。

1.3 洪湖碘泡蟲陽性重組質粒的構建

以洪湖碘泡蟲基因組DNA為模板進行常規PCR擴增。采用25 μL反應體系: 10×PCR Buffer MIX 12.5 μL, HH-F(10 μmol/L) 0.8 μL, HH-R(10 μmol/L) 0.8 μL, DNA模板2 μL, 滅菌ddH2O補加至25 μL;反應程序為: 94℃預變性5min, 94℃變性30s, 58℃退火30s, 72℃延伸30s, 共循環30次, 最后72℃延伸5min。

擴增結束后取5 μL PCR擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳, 切膠回收, 純化后的擴增片段與pMD18-T載體連接后轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞。對轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞成功的菌落純化培養, PCR鑒定篩選得到陽性克隆。將陽性克隆菌液送往武漢擎科生物技術有限公司測序。測序驗證的陽性克隆菌液使用質粒小提試劑盒作少量提取和純化。所提取的質粒純度及溶度用Nano Drop 2000測定的260/280 nm比值判斷和計算(1.8—2.0), 換算為拷貝數, 拷貝數計算公式:Nc=(6.02×1014×Cp) /(Ln+ 2694)×660,Nc為目的基因的拷貝數, 單位為 copies/μL;Cp為質粒濃度, 單位ng/μL;Ln為插入載體的基因長度, 單位bp。

1.4 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法的建立與優化

反應條件的建立: 反應體系為iQTMSYBR?Green Supermix 10.0 μL, HH-F(10 μmol/L) 0.8 μL,HH-R(10 μmol/L) 0.8 μL, 重組質粒DNA 1.0 μL,ddH2O 7.4 μL。反應程序為: 95℃預變性3min;95℃變性12s; 55℃退火20s, 72℃延伸20s, 75.5℃ 收集熒光5s, 40個循環; 溶解曲線溫度、時間設置為65℃ 5s, 95℃ 5min。反應條件的優化: 通過對反應體系中的退火溫度、重組質粒用量和引物用量等進行摸索, 獲得擴增效率高、穩定性好、無特異性擴增的反應條件。

1.5 標準曲線的建立

將測定濃度的洪湖碘泡蟲陽性重組質粒作10倍倍比稀釋, 取106—102copies/μL重組質粒為模板在優化的反應條件下同時進行擴增, 每個濃度做3個重復, 并設置空白對照。在擴增過程中, 實時熒光定量PCR儀根據不同拷貝數重組質粒擴增產物的熒光信號到達設定域值所經歷的循環數生成相應的Ct值。以106—102copies/μL重組質?？截悢档膶抵禐闄M坐標, 以相應的ΔCt值為縱坐標, 利用Excel繪制標準曲線。

1.6 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法的特異性、可重復性、靈敏性檢測

特異性檢測: 分別以洪湖碘泡蟲、多涅茨尾孢蟲、倪李碘泡蟲、普洛寧碘泡蟲、吳李碘泡蟲的基因組DNA為模板在優化的反應條件下同時進行擴增, 并設置空白對照。此外, 擴增結束后取5 μL QPCR擴增產物加loading Buffer進行2%瓊脂糖凝膠電泳,加以驗證該方法的特異性。

可重復性檢測: 將106—102copies/μL重組質粒作為模板在優化的反應條件下分別進行組內和組間重復性試驗。組內重復性試驗, 每個濃度做3個重復; 組間重復性試驗, 同一次反應每個濃度做3個重復, 重復3次反應, 同時設空白對照。通過組內和組間Ct值變異系數(標準偏差/重復值平均數), 以驗證該方法的可重復性。

靈敏性檢測: 將105—101copies/μL重組質粒作為模板分別取1 μL在優化的反應條件下和上述常規PCR條件下進行擴增, 并設置空白對照。常規PCR擴增結束后取5 μL反應產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。通過比較兩種方法的最低檢測限, 以驗證該方法的靈敏性。

1.7 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法的應用

為了驗證所建立的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR擴增方法的臨床應用性。對采集自湖北黃岡市蘄春縣八里湖五里墩正大水產(湖北)有限公司周年發生喉孢子蟲病池塘的3份發病鯽的喉部組織、3份未無明顯感染癥狀鯽的喉部組織、3份水樣和3份泥樣待檢樣品進行洪湖碘泡蟲的檢測。待檢樣品分別采用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue,EZNA Water DNA Kit, EZNA Soil DNA Kit試劑盒提取基因組DNA后, 以待檢品基因組DNA為模板,在優化的反應條件下進行擴增, 每個樣品均做3個重復, 將檢測到的ΔCt值(3個Ct值取平均值)代入建立的標準曲線方程中, 計算出樣品中洪湖碘泡蟲的初始濃度和對應初始濃度的拷貝數。

2 結果

2.1 洪湖碘泡蟲陽性重組質粒的構建

以洪湖碘泡蟲基因組DNA為模板, 使用設計合成的HH-F和HH-R引物進行常規PCR擴增, 獲得約為176 bp擴增片段。經PCR鑒定的陽性重組質粒,測序顯示擴增片段成功插入pMD-18T載體中, 說明陽性重組質粒構建成功。將構建成功的洪湖碘泡蟲陽性重組質粒在Nano Drop 2000上測得260/280 nm比值為1.97, 濃度為95 ng/μL, 對應濃度的拷貝數為3.02×1010copies/μL。

2.2 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法的建立與優化

在優化的反應條件下, SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法的擴增效率為102.3%, 擴增效率高,組內和組間重復性試驗的變異系數均小于2%, 穩定性好, 溶解曲線為單峰, 無特異性擴增。

2.3 標準曲線的建立

以3.02×106—3.02×102copies/μL重組質粒為模板在優化的反應條件下同時進行擴增, 標準曲線方程為Y=-3.2577X+39.043, 相關系數(R2)為0.999, 擴增效率為102.3%(圖 1)。重組質?？截悢档膶抵蹬cQPCR的Ct值之間呈現良好的線性關系。重組質粒對應的擴增產物溶解曲線呈現單峰,Tm值為77.5,表明無引物二聚體和非特異性擴增。

2.4 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法的特異性、可重復性、靈敏性檢測

特異性檢測: 在建立的優化的反應條件下, 分別以洪湖碘泡蟲、多涅茨尾孢蟲、倪李碘泡蟲、普洛寧碘泡蟲、吳李碘泡蟲基因組DNA為模板同時進行擴增, 只有洪湖碘泡蟲基因組DNA出現典型“S”型擴增曲線, 其余均未出現典型“S”型擴增曲線,空白對照未見擴增(圖 2)。電泳結果也顯示(圖 3),僅有洪湖碘泡蟲基因組DNA出現一條條帶, 大小約為176 bp, 而其他黏孢子蟲和空白對照均未出現條帶, 說明所建立的方法具有良好的特異性。

可重復性檢測: 將3.02×106—3.02×102copies/μL 重組質粒作為模板在優化的反應條件下分別進行組內和組間重復性試驗, 3次組內和組間重復性試驗的變異系數均小于2%(表 1), 說明所建立的方法具有較好的重復性。

圖 1 3.02×106—3.02×102 copies/μL重組質粒實時熒光定量PCR標準曲線Fig. 1 Standard curve of QPCR by using the serially diluted recombined plasmid at a concentration of 3.02×106—3.02×102 copies/μL

靈敏性檢測: 將3.02×101—3.02×105copies/μL重組質粒作為模板分別取1 μL 在優化的反應條件下和上述常規PCR條件下進行擴增, 3.02×101—3.02×105copies/μL 重組質粒均呈現典型“S”型擴增曲線(圖 4和圖 5), 最低檢測限為3.02×101copies/μL, 而普通PCR 的最低檢測限為3.02×104copies/μL, 說明所建立的熒光定量PCR方法檢出率較高, 是常規PCR方法的1000倍, 具有較高的靈敏性。

2.5 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法的應用

圖 2 實時熒光定量PCR特異性性檢測Fig. 2 Specificity of the developed QPCR

圖 3 電泳檢測QPCR的特異性Fig. 3 Specificity of the developed QPCR detected by gel electrophoresis

采用所建立的洪湖碘泡蟲SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法對采集自蘄春周年發生喉孢子蟲病池塘的3份鯽喉部組織、3份無明顯感染癥狀的鯽喉部組織、3份水樣和3份泥樣樣品進行洪湖碘泡蟲的檢測, 空白對照(ddH2O)無擴增, 在3份鯽喉部組織、3份未無明顯感染癥狀的鯽喉部組織、3份水樣和3份泥樣樣品均能檢測到洪湖碘泡蟲(表 2)。這說明所建立的方法擴增效果良好, 既能從發病的鯽喉部組織中檢測出洪湖碘泡蟲, 又能從未發病但已感染的鯽喉部組織中檢測出洪湖碘泡蟲。對周年發病池塘的水樣與泥樣環境樣品中的洪湖碘泡蟲定量檢測結果表明, 采樣池塘存在洪湖碘泡蟲蓄積, 具備鯽喉孢子蟲病發病風險。同時也表明, 采樣時, 水柱中存在感染源, 為采取相應的措施滅活或消降感染源豐度以降低發病風險提供了技術支撐。

3 討論

在建立SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測病原生物的過程中, 選擇合適的靶序列尤為重要。在洪湖碘泡蟲的早期分子檢測中, 應用到的分子標記主要有18S rDNA和ITS區序列[8,9], 然而通過序列比對發現洪湖碘泡蟲與吳李碘泡蟲的18 SrDNA序列相似度為93%, ITS序列相似度為69%, 因此我們選擇變異度較大的核糖體間隔區域(ITS)為引物設計靶序列, 建立洪湖碘泡蟲的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法。

表 1 SYBR Green I實時熒光QPCR方法的組內與組間重復性試驗Tab. 1 Intraassay and interassay repeatability tests of the SYBR Green I real-time QPCR assay

圖 4 實時熒光定量PCR靈敏性檢測Fig. 4 Sensitivity of the developed QPCR

圖 5 常規PCR靈敏性檢測Fig. 5 Sensitivity of the conventional PCR

通過以洪湖碘泡蟲的ITS基因為靶標設計特異性引物, 對退火溫度、重組質粒用量和引物用量等進行摸索, 優化反應條件, 建立了洪湖碘泡蟲SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法。該方法的標準曲線方程為Y=-3.2577X+39.043, 相關系數(R2)為0.999, 擴增效率為102.3%, Eff%在90%—110%[16],具有良好的線性關系; 溶解曲線為單峰, 產物的Tm值均一, 沒有引物二聚體和非特異性擴增。為了驗證所建立方法的特異性, 采用該方法對4種黏孢子蟲進行檢測, 并將擴增產物進行電泳分析, 由實驗結果可知, 所建立的方法與4種黏孢子蟲均不發生交叉反應, 表明該方法具有較好的特異性, 可以特異地檢測洪湖碘泡蟲?？紤]到魚類黏孢子蟲多樣性眾多, 今后應擴大特異性檢測種類范圍, 以進一步該方法的特異性。由靈敏性實驗結果可知, 該方法的最低檢測限為3.02×101copies/μL(9.5×10-8pg/μL), 比李丹[10]建立的洪湖碘泡蟲PCR檢測方法的靈敏度(1×10-6pg/μL)高出約兩個數量級, 與普通PCR相比, 靈敏度高出常規PCR約1000倍, 表明該方法具有較高的靈敏性。由可重復性實驗結果可知, 組內和組間重復性試驗的變異系數均小于2%,表明該方法具有較好的穩定性和可重復性。

表 2 臨床樣品的SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測Tab. 2 Detection results of clinical samples by the developed SYBR Green I real-time PCR

采用所建立的方法對臨床樣品進行洪湖碘泡蟲的檢測。結果表明, 該方法擴增效果良好, 不僅能從發病的鯽喉部組織中檢測出洪湖碘泡蟲, 還能從未發病但已感染的鯽喉部組織中檢測出洪湖碘泡蟲。不僅如此, 本方法可應用于周年發生喉孢子蟲病的池塘水樣、泥樣環境樣品中洪湖碘泡蟲的定量監測, 為實時監控養殖系統中病原的豐度, 實施對鯽喉孢子蟲病的早期干預措施奠定了技術基礎。

綜上所述, 本研究所建立的洪湖碘泡蟲SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法具有很好的特異性、較高的靈敏性、較好的穩定性和重復性、良好的應用性, 既可以用于臨床的快速早期檢測,又可對環境中的洪湖碘泡蟲進行實時監控, 為洪湖碘泡蟲病的診斷和防控提供了有力的技術支持。