鰻鱺腎臟細胞系的建立及其對鰻鱺皰疹病毒的敏感性

李苗苗 吳 斌 林 楠 王曉偉 江小斌 林國清 樊海平

(1. 福建省水產技術推廣總站, 福州 350002; 2. 福建海洋職業技術學校, 福州 350012; 3. 福州市海洋與漁業技術中心, 福州350026; 4. 福建省淡水水產研究所, 福州 350002)

魚類細胞系作為重要的實驗材料, 具有成本低廉、實驗可重復性和可控性強、取樣及觀測簡便、利于進行大量樣本分析等顯著優點, 被廣泛用于水生生物病毒學、發育生物學、遺傳學、免疫學、毒理學和藥理學等研究領域[1]。魚類細胞培養最主要應用于病毒的分離、純化和鑒定[2]。1962年Wolf和Quimby[3]利用細胞培養技術分離培養了傳染性胰臟壞死病毒(第一個魚類病毒)。根據Lai等[4]研究報道, 同一種魚不同組織的細胞系對同一種病毒的敏感性不同。而同一個細胞系, 對不同的病毒敏感性也不同。所以不同魚類細胞系的建立對病毒的研究十分必要[2]。

鰻鱺(Anguilla anguilla)是我國重要的經濟魚類之一, 具有較高的營養價值[5,6], 但隨著鰻鱺養殖業的發展, 鰻鱺養殖過程中病害的發生也逐漸增多,給養殖戶帶來極大的經濟損失, 制約了鰻鱺養殖業的健康發展[7—9]。鰻鱺病害病原有細菌、病毒、寄生蟲等, 其中對鰻鱺危害最大的疾病是病毒性疾病, 其診斷和防治難度均高于其他病原引起的疾病。病毒只能在天然宿主或適合的細胞內增殖[10],因此, 建立鰻鱺細胞系是對鰻鱺病毒分離和培養,開展鰻鱺病毒性疾病流行病學調查和病原生物學研究非常重要。目前, 國內外已經開展了鰻鱺組織細胞系建立工作, 并開展了體外培養條件優化相關研究。Chen和Kou[11]以日本鰻鱺為實驗材料建立了鰻鱺卵巢細胞系, 莊道華等[12,13]以歐洲鰻鱺為實驗材料建立了鰻鱺尾鰭細胞系, 毛凝等[2,10]開展了歐洲鰻鱺胸鰭細胞培養條件優化等方面的研究工作。

本研究以歐洲鰻鱺腎臟組織為材料, 建立了鰻鱺腎臟細胞系EEK, 并開展了EEK培養條件的優化以及其對鰻鱺皰疹病毒敏感性的實驗, 探討EEK體外培養的最適條件, 為鰻鱺病毒性病原的分離鑒定和性質分析提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗魚健康歐洲鰻鱺取自福建省建甌市融泉水產養殖有限公司, 規格為0.5 kg, 活力良好。

主要試劑培養液L15(Hyclone)、MEM(Hyclone)、胎牛血清(Fetal Bovine Serum, Hyclone)、胰蛋白酶(TRYPSIN 0.25% EDTA)、Phosphate Buffered Saline(PBS)購自廈門泰京生物科技有限公司。培養液DMEM/F12 1限公司。培養液DMEM/F12 1∶1(3 g/L HEPES; 2 mmol/L L-丙氨酰-谷氨酰胺), 重組鼠堿性成纖維生長因子(FGF-basic, Murine), N-乙酰葡萄糖胺(N-AG), 羧甲基纖維素鈉(CMC), β-巰基乙醇(2-ME), 100×雙抗(青霉素和鏈霉素), 二甲基亞砜(DMSO)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。完全培養液: DMEM/F12+20%FBS+50 μg/mL N-AG+50 μg/mL CMC+0.1 mol/L 2-ME+10 μg/L FGF-basic+100 IU/mL 青霉素+100 μg/mL 鏈霉素; 細胞凍存液: 90% FBS+10% DMSO。

1.2 原代培養

將健康歐洲鰻鱺洗凈用適量丁香酚進行麻醉后移入細胞操作間, 在無菌條件下解剖魚體, 取出約0.5 cm3腎臟組織, 用手術刀片將組織塊切碎至約1 mm3。在室溫條件下, 1500×g離心2min, 棄上清。加入3 mL 0.25%胰蛋白酶室溫消化10min, 1500×g離心2min, 棄上清, 加入適量細胞完全培養液終止胰蛋白酶的消化作用, 將組織塊移入25 cm2細胞培養瓶中, 均勻鋪開于瓶底, 吸取多余的培養液, 于27℃倒置培養。24h后緩慢加入5 mL完全培養液,啟動原代培養, 每周更換一次培養液。

1.3 傳代培養

逐日觀察原代培養情況, 當觀察到有大量腎臟細胞從組織塊遷出并在組織塊周圍形成環形生長暈時, 移除舊培養液, 用5 mL PBS清洗1—2次, 加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化約2min后加入含血清的完全培養液, 以適當比例接種至新的培養瓶中, 補齊每瓶培養液至5 mL后置于27℃培養。

1.4 細胞凍存與復蘇

選取處于生長對數期的鰻鱺腎臟細胞, 經胰蛋白酶消化, 1500×g室溫離心2min后收集細胞沉淀,加入細胞凍存液, 輕輕混勻后轉移至凍存管, 置于程序降溫盒于-80℃放置1d后轉移至液氮罐中長期保存。

取凍存3個月的細胞系進行復蘇檢測: 從液氮中取出凍存的鰻鱺腎臟細胞凍存管, 快速放置于水浴鍋(27℃)中, 使其解凍。完全融化的細胞懸液經1500×g室溫離心2min后棄上清, 加入培養液, 轉移至培養瓶, 置于27℃培養。

1.5 細胞培養條件優化

最佳培養液選取生長良好的鰻鱺腎臟細胞, 經胰酶消化后分別用DMEM/F12、L15、MEM完全培養液(均含10% FBS)進行培養, 并分別用相應培養液調節細胞濃度為5×104個/mL, 置于27℃培養, 每天計數一次, 連續計數7d。每組設置3個重復,取3次計數的平均值作為試驗數據。

最適血清濃度選取生長良好的鰻鱺腎臟細胞, 經胰酶消化后分別用含5%FBS、10% FBS、15% FBS和20% FBS的DMEM/F12完全培養液進行培養, 并分別用相應培養液調節細胞濃度為5×104個/mL, 置于27℃培養, 每天計數一次, 連續計數7d。每組設置3個重復, 取3次計數的平均值作為試驗數據。

最適培養溫度選取生長良好的鰻鱺腎臟細胞, 經胰酶消化后用DMEM/F12完全培養液(含10% FBS)進行培養, 并調節細胞濃度為5×104個/mL, 分別置于17℃、22℃、27℃、32℃進行培養,每天計數一次, 連續計數7d。每組設置3個重復, 取3次計數的平均值作為試驗數據。

1.6 細胞染色體觀察和分子鑒定

將傳代至35代的鰻鱺腎臟細胞接種至培養瓶中培養48h, 加入終濃度為10 μg/mL的秋水仙堿, 繼續培養12h后收集細胞, 經固定、染色、干燥、封片后觀察。

選取生長良好的鰻鱺腎臟細胞, 消化后收集細胞沉淀, 提取細胞總DNA, 以細胞DNA為模板, 采用Jochen Trautner[14]建立的方法進行PCR鑒定, 引物序列見表 1。在PCR擴增結束后, 1%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果, 并將PCR產物送生物公司進行測序。

1.7 鰻鱺皰疹病毒敏感性實驗

鰻鱺病料收集從福建省某鰻鱺養殖廠, 取出現“脫黏敗血病”典型癥狀的疑似為鰻鱺皰疹病毒(AnHV)陽性病料, 分離鰓、肝、腎、脾組織, 勻漿后分為2份: 1份用于鰻鱺皰疹病毒PCR檢測用,另1份用于接種鰻鱺腎臟細胞。

表 1 鰻鱺腎臟細胞PCR鑒定引物序列Tab. 1 PCR primers for EEK cells detection

病毒感染細胞將上述1份組織勻漿液經0.22 μm微孔過濾除菌后, 接種至長滿的鰻鱺腎臟細胞單層中, 于27℃吸附1—2h; 補足細胞培養液,于27℃培養箱中培養, 7d內逐日觀察細胞病變(CPE)情況并記錄; 若7d內未出現CPE, 則將細胞培養物凍融一次, 收集上清液繼續接種新的鰻鱺腎臟細胞。同時設正常鰻鱺腎臟細胞作為對照。

病毒的PCR鑒定分別提取病料組織DNA和感染鰻鱺腎臟細胞的病毒懸液DNA, 用特異性擴增鰻鱺皰疹病毒DNA聚合酶基因的引物進行PCR擴增, 引物序列見表 1。在PCR擴增結束后, 1%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果, 并將PCR產物送生物公司進行測序。

2 結果

2.1 原代培養和傳代培養

鰻鱺腎臟組織啟動原代培養后4d左右, 從組織塊周圍有少量細胞遷移出來, 至第14天左右圍繞組織塊逐漸有大量細胞遷出(圖 1A和圖 1B)。這時,可經胰蛋白酶消化、傳代, 開始鰻鱺腎臟細胞傳代培養。鰻鱺腎臟細胞生長穩定后形態為較長的類纖維狀(圖 1C和圖 1D), 并在不同代數細胞之間保持穩定。

2.2 細胞凍存與復蘇

將凍存3個月的鰻鱺腎臟細胞系從液氮中取出進行復蘇, 培養2d后在顯微鏡下進行觀察, EEK細胞存活率為80%以上, 細胞形態與凍存前無明顯差別(圖 2), 繼續培養2—3d, EEK細胞可長滿瓶底, 并且可以進行傳代培養。

2.3 細胞培養條件優化

最佳培養液 鰻鱺腎臟細胞系在三種不同的培養液(DMEM/F12、L15、MEM)中進行培養,結果顯示, DMEM/F12和L15培養液均可支持EEK的正常生長和增殖(圖 3A和圖 3B), 在第2至第5天, 增殖迅速, 細胞數目明顯增加(圖 4), 而在MEM培養液中, EEK無法正常增殖, 細胞形態發生變化, 逐漸收縮、脫壁, 細胞逐漸死亡、數目不斷減少(圖 3C和圖 4)。

最適血清濃度如圖 5所示, 在5%—15%FBS濃度條件下, 隨著FBS濃度的增加, EEK增殖速率和細胞數目呈逐漸增大的趨勢, 在10%和15%FBS濃度條件下, EEK生長曲線大致吻合, 而FBS濃度繼續增加至20%時, 細胞增殖速率和細胞數目又呈現下降的趨勢。

最適培養溫度如圖 6所示, 在17℃培養溫度下, EEK細胞生長緩慢, 22—32℃內均可正常生長和增殖, 27℃培養溫度下增殖最快, 當溫度增高至32℃時, EEK細胞生長速率大幅下降且細胞數目不斷減少。

2.4 細胞染色體觀察和分子鑒定

隨機選取不同視野下的EEK中期分裂相細胞進行染色體觀察和數目統計分析, 發現50%以上的細胞具有38條染色體(圖 7和圖 8)。

以EEK細胞DNA為模板, 采用Jochen Trautner建立的方法進行PCR鑒定, 1%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖 9所示, 在約790 bp處有單一條帶。將PCR擴增產物測序結果(圖 10)在NCBI網站進行Blast分析, 結果顯示該序列與歐洲鰻鱺Mitochondrialcytochromeb基因序列同源性為99%, 表明該細胞確為歐洲鰻鱺組織細胞。

2.5 鰻鱺皰疹病毒敏感性實驗

病毒感染細胞將鰻鱺皰疹病毒陽性病料組織上清液接種EEK細胞, 在27℃培養條件下, 第3天, EEK細胞出現明顯病變, 表現為細胞逐漸收縮、變圓、脫壁懸浮, 逐漸裂解死亡, 而對照組細胞正常生長(圖 11)。

病毒的PCR鑒定用特異性擴增鰻鱺皰疹病毒DNA聚合酶基因的引物對鰻鱺皰疹病毒陽性病料組織DNA和感染鰻鱺腎臟細胞的病毒懸液DNA進行PCR擴增, 擴增出與預期大小一致的單一條帶(圖 12)。將PCR擴增產物送生物公司測序后進行序列比對分析, 結果顯示所得序列與AnHV DNA聚合酶基因序列完全一致(圖 13), 表明本實驗鰻鱺皰疹病毒成功感染到EEK細胞。

3 討論

魚類組織在體外培養時的環境與體內有很大差異, 但是能適應這種差異的細胞可以逐漸從體外培養的組織塊遷移出來, 進行增殖并逐漸形成穩定的形態[15—18]。本研究在莊道華等[12,13,18]的研究基礎上成功建立了鰻鱺腎臟組織細胞系EEK, 目前EEK已傳至38代, 細胞增殖形態良好, 呈典型的類纖維狀。

圖 3 EEK細胞在不同培養液中的生長情況(bar=200 μm)Fig. 3 Morphology of EEK cells in different culture media (bar=200 μm)A. DMEM/F12 (4th day); B. L15 (4th day); C. MEM (4th day)

圖 4 EEK細胞在不同培養液中的生長曲線Fig. 4 The growth curves of EEK cells in different culture media

圖 5 EEK細胞在含不同濃度FBS的培養液中的生長曲線Fig. 5 The growth curves of EEK cells in DMEM/F12 with different FBS concentrations

魚類細胞培養常用的培養基有L15、RPMI-1640、M199、DMEM/F12、MEM等, 本研究選取L15、DMEM/F12、MEM三種培養基進行EEK的優化實驗。結果表明, 細胞在L15和DMEM/F12培養基中生長較好, 細胞呈類纖維狀, 可正常增殖和傳代, 而在MEM培養基中無法正常生長, 細胞由類纖維狀逐漸收縮變圓, 細胞濃度逐漸低于接種前,并逐漸有大量死亡細胞懸浮在培養基中。

目前, 大多數細胞在體外培養時都需要在培養液中添加血清。但是, 細胞的生長情況并非與血清濃度成正相關。一般情況下, 體外細胞培養常用的血清濃度為10%—20%。本研究中發現, EEK細胞在FBS濃度為10%和15%的培養基中, 生長情況較好, 而在FBS濃度為20% 的培養基中, 細胞增殖速率和密度均低于前者, 說明血清并非濃度越高越有助于EEK細胞的生長, 而EEK細胞在FBS濃度為5%的培養基增殖最慢, 細胞密度最低。

圖 6 EEK細胞在不同培養溫度下的生長曲線Fig. 6 The growth curves of EEK cells under different temperatures

圖 7 第35代鰻鱺腎臟細胞系染色體Fig. 7 Chromosome of EEK cells of the 35th generation

圖 8 第35代鰻鱺腎臟細胞系染色體數目的分布Fig. 8 Number frequency of chromosomes of EEK of the 35th generation

圖 9 鰻鱺腎臟細胞系PCR鑒定結果Fig. 9 EEK cell line PCR identification results 1. DNA Marker; 2. EEK DNA; 3. Blank control

圖 10 鰻鱺腎臟細胞系PCR擴增產物測序結果Fig. 10 The sequence of PCR product of EEK cell line

Wolf等[18]認為, 魚類細胞系在進行體外培養時, 培養溫度與魚種本身的最適溫度相關。EEK細胞的生長速度在17—27℃內, 隨著溫度的升高而增加, 27℃時細胞的生長速度最快為其最適生長溫度,這與鰻鱺本身適宜的生長溫度有關。17℃時細胞生長速度較慢, 32℃培養溫度下, 僅有少量細胞存活, 且細胞幾乎無法增殖。溫度過高導致細胞內與增殖相關酶的活性有所降低, 從而使細胞的增殖速率變慢[19]。因此, 進行細胞原代培養時, 最好選擇適宜魚生長的溫度。

體外細胞培養時常發生染色體組的非整倍化現象, 其發生機制尚未闡明, 目前認為, 可能是因為染色體在細胞分裂過程中發生分離異常導致[20]。在本研究中, 雖然部分細胞出現了非整倍化現象,但50%以上觀測到的分裂相細胞具有38條染色體,這與前人對鰻鱺細胞系的研究相一致[10]。研究表明, 在體外傳續多代的情況下, 非異倍體魚類體細胞系的染色體數符合眾數特征的比例多在50%—70%[21—25], EEK細胞的染色體組型也符合上述特征,表明該細胞系仍屬于二倍體細胞系。

圖 11 EEK細胞皰疹病毒敏感性實驗(bar=200 μm)Fig. 11 The sensitivity test of EEK cells infected with AnHV(bar=200 μm)

魚類細胞系是魚類病毒分離、培養和鑒定的重要載體, 不同細胞系對不同魚類病毒的易感性有所不同。本研究中, 對EEK細胞系進行了鰻鱺皰疹病毒敏感性實驗。結果表明, EEK細胞系可在An-HV感染后3d出現明顯的細胞病變, 病毒感染細胞上清液的AnHV分子鑒定結果為陽性, 進一步證實了EEK對AnHV的敏感性。EEK的建立為鰻鱺病毒性疾病的診斷以及病原生物學研究提供了重要的工具。

圖 12 AnHV病毒的PCR鑒定結果Fig. 12 The PCR identification results of AnHV

圖 13 病毒PCR鑒定擴增產物序列Fig. 13 The sequence of PCR product of AnHV

綜上所述, 本研究成功建立了鰻鱺腎臟組織細胞系EEK, 細胞形態為類纖維狀, 在體外連續傳代近40次仍保持旺盛的細胞增殖能力。該細胞系的建立對于鰻鱺病毒性疾病的診斷、病原生物學研究、病毒性病原的分離鑒定和性質分析、致病機理研究以及疫苗研制等具有重要意義。

致謝:

本研究中EEK細胞染色體觀察及分子鑒定由福建師范大學黃鎮博士協助完成, 在此表示感謝。