無機三價砷對黃花水龍無菌苗生理生化特性的影響

呂金平 張詩雯 李 濤 趙進東

(1. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

砷(As)是一種劇毒類金屬, 對生物體具有致癌、致突變的效應, 已被世界衛生組織確定為高毒致癌物質。由于其與重金屬具有相似的毒性和污染性, 常被列為重金屬來研究。我國是世界上砷污染較為嚴重的國家之一[1], 污染源主要來自于礦石[2]、冶金業廢水及含砷化學品等。長期以來, 由于我國工農業的迅猛發展, 含砷礦物及其化合物頻繁開采、利用, 導致其以不同形式排放到環境中,并不斷積蓄流轉, 污染大氣、土壤、地下水及河流[3]。砷對植物的毒性效應與砷的價態密切相關,水體中的砷主要以無機砷酸鹽和亞砷酸鹽形式存在, 對水生植物的毒性較大[4], 其中As (Ⅴ) 通過取代磷酸鹽, 主要干擾植物的磷代謝反應, 而As (Ⅲ)的毒性是As (Ⅴ) 的25—60倍[5], 易與蛋白質上的巰基 結合, 影響細胞內相關蛋白質的結構、功能, 進而影響葡萄糖的吸收、糖異生作用以及乙酰輔酶A和谷胱甘肽的生成[6]。黃花水龍(Jussiaea stipu-laceaOhwi)屬于柳葉菜科丁香蓼屬, 多年生草本植物, 生命力極強, 可較好的吸收富營養水體中氮、磷[7], 且能顯著降低水體pH至中性水平, 對維持水生態系統穩定提供保障。目前關于砷對植物污染的研究多涉及農業作物[8—11], 而對于水生植物影響的研究還較缺乏, 本研究選取黃花水龍無菌苗為實驗材料, 通過不同濃度As3+處理, 從光合系統、滲透壓調節系統、抗氧化系統等方面研究黃花水龍無菌苗對無機三價砷污染的響應, 并進一步探討砷毒害黃花水龍的機制, 為環境檢測中評價黃花水龍受污染程度和進一步研究黃花水龍用于砷污染水體修復的可能性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料的預處理

黃花水龍無菌苗培養方法:本實驗材料采自廣東饒平水庫, 選取生長健壯的黃花水龍, 以黃花水龍帶腋芽莖段為外植體, 剪取長3.0—5.0 cm的帶腋芽莖段, 自來水沖洗1h, 取帶側芽的莖置于經紫外滅菌處理的超凈工作臺中, 先用75%酒精表面消毒處理10s, 無菌水沖洗5次, 再用0.1%氯化汞消毒5min, 無菌水沖洗3次, 將消毒處理后的黃花水龍莖剪成1.0—1.5 cm長, 辨認形態學上端后, 置于MS培養基(含6-BA 0.05 mg /L, NAA 0.05 mg /L)誘導芽分化, 15d左右莖間側芽約3 cm長, 轉入MS繼代培養基(含6-BA 0.25 mg /L, NAA 1.5 mg /L) 繼代培養1個月后, 將長勢基本一致的黃花水龍無菌苗剪取約5 cm左右長度的莖置于1/10的無菌Hoagland營養液中, 用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl調節營養液pH至5.5左右, 每3天更換一次培養液, 待其長勢良好以備隨后實驗。整個組培過程在全封閉培養箱進行，培養溫度為25℃, 每天光照12h, 光照強度為40 μE/(m2·s)。

1.2 實驗設計

依據預試驗結果, 待黃花水龍無菌苗長至7—10 cm 時, 選取長勢基本一致的植株作為供試植株,置于含0 (對照)、2.5、10、50、250和500 μmol/L NaAsO2(以純As3+計) 的1/10 Hoagland無菌營養液中, 整個毒害實驗都在全封閉培養箱中完成, 條件同培養黃花水龍無菌苗時一致, 脅迫24h, 在相同的時間段內取出黃花水龍無菌苗, 去離子水洗凈、揩干, 進行各項生理生化指標測定, 每組設置3個重復。

1.3 實驗方法

葉綠素含量的測定參照張憲政[12]的丙酮乙醇浸提法。全程在暗光條件下操作, 紫外-可見分光光度計測量663 和645 nm波長下比色, 并按Amon法計算求得葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量。

相關生理指標的測定丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸法測定[13]?？扇苄缘鞍?SP)含量的測定采用考馬氏亮藍G-250法[14], 以牛血清蛋白為標準蛋白, 測定595 nm下的吸光度?？扇苄蕴?SS)含量的測定采用蒽酮比色法[14]。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性的測定如下: 取材置于預冷研缽中, 加入0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH 7.4), 冰浴研磨, 3500 r/min, 離心10min, 取上清液進行測定。SOD、CAT活性采用一般分光光度法, POD活性采用愈創木酚法。

1.4 統計分析

使用Microsoft Excel和SPSS 23.0進行數據統計和單因素方差分析, 采用Tukey法進行多重比較, 以P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著相關, 結果以“均值±標準差”表示, 本文圖表中的不同小寫字母表示數值之間差異顯著(P＜0.05), 相同字母表示差異不顯著(P＞0.05)。

圖 1 不同As (Ⅲ)濃度黃花水龍無菌苗葉綠素的含量Fig. 1 Chlorophyll contents of Jussiaea stipulacea Ohwi under different concentrations of As (Ⅲ)

2 結果

2.1 As (Ⅲ)對黃花水龍葉綠素含量的影響

葉綠素作為植物光合作用的物質基礎, 常作為抗性指標用于評價污染物對植物生長的影響, 揭示葉片光合作用能力和衰老程度[15]。由圖 1可知, 在亞砷酸鈉脅迫下, 黃花水龍葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量均隨砷處理濃度的升高呈先升后降的趨勢, 其中黃花水龍葉綠素a含量在處理濃度為2.5 μmol/L時含量較對照組有所升高, 但未達到顯著水平, 隨后含量逐漸降低, 并在處理濃度為500 μmol/L時含量降至0.691 mg/g, 顯著低于對照組。而葉綠素b和葉綠素總量分別在0.64—0.689 mg/g和1.331—1.487 mg/g, 均在低濃度砷(2.5 μmol/L)處理條件下含量顯著升高, 分別升高到0.797和1.487 mg/g, 較對照組分別升高11%和7%, 與對照組呈顯著差異。而后隨著As3+濃度升高, 較對照組含量逐漸降低, 但未達到顯著差異水平。

2.2 As (Ⅲ)對黃花水龍丙二醛含量的影響

在植物處于逆境、脅迫、衰老情況下, 其細胞內固有的自由基代謝平衡遭到破壞, 導致細胞質膜中的不飽和脂肪酸過氧化作用加劇, 生成膜脂過氧化產物, 影響植物的光合、呼吸及其他代謝過程。丙二醛(MDA)作為脂質氧化終產物, 具有細胞毒性,能加劇膜損傷, 干擾細胞正常生命活動, 影響植物生長發育, 其含量變化可反映膜系統受損程度以及植物受逆境傷害的程度[16]。如圖 2可知, 黃花水龍無菌苗MDA含量范圍在2.36—9.83 nmol/g, 且處理組MDA含量均高于對照組, 對照組MDA含量最低, 為2.36 nmol/g, 當As (Ⅲ) 處理組濃度達到500 μmol/L時, MDA含量最高, 為9.83 nmol/g, 顯著高于對照組, 在處理濃度低于500 μmol/L時, 各處理組和對照組差異不顯著。

圖 2 不同As (Ⅲ)濃度黃花水龍無菌苗丙二醛的含量Fig. 2 MDA contents of Jussiaea stipulacea Ohwi under different concentrations of As (Ⅲ)

2.3 As (Ⅲ)對黃花水龍滲透調節物質的影響

可溶性糖植物體內的可溶性糖作為植物細胞滲透壓的重要調節物質,其含量可以反映碳水化合物的運轉情況和逆境脅迫條件下水生植物生理生態變異情況[17]。圖 3結果表明: 隨著As (Ⅲ)濃度的升高, 可溶性糖含量呈先降后升的趨勢, 具體表現為: 可溶性糖含量在1.17—2.627 mg/g波動, 在As (Ⅲ)濃度為0—50 μmol/L時, 可溶性糖含量均較對照組顯著降低, 并在As (Ⅲ)濃度為10 μmol/L時達到最小值, 為1.17 mg/g, 相比于對照組降低52.5%,而后隨著As (Ⅲ)濃度升高, 可溶性糖含量升高, 且在濃度為250 μmol/L時含量達到最大值, 為2.627 mg/g。

圖 3 不同As (Ⅲ)濃度黃花水龍無菌苗可溶性糖的含量Fig. 3 Soluble sugar contents of Jussiaea stipulacea Ohwi under different concentrations of As (Ⅲ)

可溶性蛋白可溶性蛋白同樣作為植物體內重要的滲透性物質, 可以提高植物生理保水能力。研究其含量變化是了解植物生理生化變化的重要途徑[18], 由圖 4可知, 隨著As (Ⅲ)處理濃度的增大, 黃花水龍無菌苗可溶性蛋白質含量范圍在4.25—11.09 mg/g, 呈先增后減趨勢, 當As (Ⅲ)處理濃度在0—250 μmol/L時, 可溶性蛋白含量逐漸增加, 并在250 μmol/L時達到最大值, 顯著高于對照組(P＜0.05), 當處理濃度繼續增大到500 μmol/L, 可溶性蛋白質含量有所降低。實驗結果表明低濃度砷脅迫對黃花水龍可溶性蛋白含量有顯著激活功能,從而提高細胞滲透濃度和功能蛋白含量, 維持正常細胞代謝水平。當砷脅迫濃度達到較高水平則對蛋白質有一定破壞作用, 可能是由于高濃度砷進一步造成可溶性蛋白質合成與分解相關酶活性受到影響及機體組織和器官不可逆的損害, 導致植物體內可溶性蛋白和蛋白質的分解運輸受到阻礙。

2.4 As (Ⅲ)對黃花水龍抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶系統是植物的主要防御酶系統, 可避免或減輕活性氧對植物造成的損害, 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)是植物細胞膜保護系統組成酶, 被認為是清除活性氧過程中最主要的抗氧化酶, 在因活性氧引發抗氧化脅迫時, 能在生理水平起到防御保護作用并維持氧化代謝平衡[19,20]。

SOD活性SOD活性大小可以直接反應機體清除自由基的能力, 與逆境生長下的植物密切相關。如圖 5所示, 黃花水龍無菌苗的SOD活性單位在623.777—747.327 U/g FW, 對照組SOD活性最低,為623.777 U/g FW, 隨著As (Ⅲ)處理濃度升高,SOD活性呈先升高后下降的趨勢, 且As 10 ＞As 50 ＞As 250 ＞As 2.5 ＞As 500, 當As (Ⅲ)濃度處于2.5—50 μmol/L, SOD活性顯著升高, 體內抗氧化防御系統被激活, 以維持氧化還原平衡,且當處理濃度為10 μmol/L時, SOD活性達到最大值, 為747.327 U/g FW, 是對照組的120%, 顯著高于對照組, 而當As(Ⅲ)濃度大于10 μmol/L時, SOD活性持續降低。在高濃度砷條件下黃花水龍無菌苗SOD活性的下降表明, 此時高濃度砷脅迫可能已超出SOD系統發揮正常功能所能承受的濃度上限, 使得SOD防御系統遭到破壞, 活性氧清除能力降低, 導致了黃花水龍無菌苗的毒性效應。

圖 4 不同As (Ⅲ)濃度黃花水龍無菌苗可溶性蛋白的含量Fig. 4 Soluble protein contents of Jussiaea stipulacea Ohwi under different concentrations of As (Ⅲ)

圖 5 不同As (Ⅲ)濃度黃花水龍無菌苗SOD的活性Fig. 5 SOD activity of Jussiaea stipulacea Ohwi under different concentrations of As (Ⅲ)

POD活性POD是植物抗氧化系統的重要組成部分, 廣泛存在于植物、動物和微生物體內,和CAT都可以催化SOD等產生的H2O2與其他底物反應, 將其轉化為H2O, 使自由基維持在正常的動態水平, 保護細胞免受有毒過氧化物的損害, 維護細胞膜的正常代謝功能, 提高植株的抗逆性[18]。其活性值在一定程度上反應植物對逆境的耐受能力。根據圖 6結果所示: 黃華水龍無菌苗POD活性為51.79—117.53 U/mg prot, 在As (Ⅲ)濃度為0—50 μmol/L時, POD活性在低濃度下不斷被激活, 其中當As (Ⅲ)濃度為2.5 μmol/L時, POD活性最高, 達113.06 U/mg prot, 是對照組的119%, 在As (Ⅲ)濃度為250—500 μmol/L時, POD活性呈顯著下降趨勢,較于對照組, 分別降低了41%和45%, 說明低濃度砷脅迫激發了黃花水龍體內防御機制, 增加了黃花水龍無菌苗的POD活性, 從而較好的應對砷脅迫帶來的傷害。而高濃度砷脅迫降低了POD活性?？梢?POD對清除活性氧產生, 降低砷脅迫對黃花水龍幼苗的氧化損傷方面發揮著作用。

CAT活性過氧化氫酶是一種含Fe的血紅蛋白酶類, 主要存在于細胞的過氧化體中, 也是抗氧化酶系統的重要組成部分, 可以使細胞內過氧化氫維持在正常水平, 從而保護細胞膜結構。結果如圖 7所示: 在砷脅迫處理后, 黃花水龍無菌苗CAT活性均高于對照組且呈現先上升后下降的趨勢, 在砷濃度為50 μmol/L時活性最高, 與對照相比增加了185%, 顯著高于對照組。低濃度的砷對CAT活性有激活效應, 但隨著濃度不斷升高[As (Ⅲ)≥250 μmol/L時]CAT活性受到抑制, 這表明低濃度砷脅迫下黃花水龍體內產生了過多的過氧化氫, 作為一種防御系統, 通過提高CAT活性以清除過氧化氫,但當濃度超過極限, 過多的過氧化氫會對植物細胞造成損傷, CAT防御系統遭到破壞。

圖 6 不同As (Ⅲ)濃度黃花水龍無菌苗POD的活性Fig. 6 POD activity of Jussiaea stipulacea Ohwi under different concentrations of As (Ⅲ)

圖 7 不同As (Ⅲ)濃度黃花水龍無菌苗的CAT活性Fig. 7 CAT activity of Jussiaea stipulacea Ohwi under different concentrations of As (Ⅲ)

3 討論

已有報道砷脅迫對水生植物影響的研究[21,22],多采用野外采集植物作為實驗對象, 未進行無菌處理, 實驗結果易受干擾因素影響, 本實驗采用黃花水龍無菌苗進行砷脅迫下研究, 盡可能排除如微生物、共生植物[23]、植株個體差異及人為作用等外界干擾因素, 確保實驗結果較為準確可控。

3.1 對葉綠素含量的影響

類重金屬脅迫作為一種逆境, 往往表現出對植物生長“低促高抑”現象。光合作用是植物重要的基礎生理活動, 葉綠素是最主要的光合色素, 具有捕獲光能, 驅動電子轉移到反應中心的功能[24], 葉綠素含量的變化能較好反映植物生長狀況及光合作用能力水平, 楊文婕等[25]、賴長鴻等[26]研究均表明: 低濃度砷處理對植物葉綠素含量有促進作用,而過量的砷毒害則導致植物葉綠素含量降低, 薛艷等[17]研究鎘和鉛對黃花水龍葉綠素含量影響, 結果顯示當鎘和鉛濃度為1 μmol/L時, 葉綠素含量均較對照組顯著升高, 隨著處理濃度的升高至5 μmol/L以上, 葉綠素含量逐漸降低。本實驗結果顯示, 低濃度砷處理(2.5 μmol/L)促進了黃花水龍無菌苗的葉綠素b和葉綠素總量的增加, 且顯著高于對照組,而葉綠素a含量變化不顯著, 隨著砷處理濃度不斷升高直至500 μmol/L時, 葉綠素b和葉綠素總量有下降的趨勢, 但未達到顯著差異水平, 而葉綠素a含量下降至顯著水平。由于葉綠素的生物合成需要經過一系列的酶促反應, 造成這種現象的原因可能是在低濃度砷脅迫條件下可促進植物對Fe、Mg等元素的吸收, 促進植物合成較多的葉綠素, 而在高濃度處理下, 砷作為類重金屬進入植物體內, 與葉綠體中蛋白質上的巰基結合或取代其中的 Fe2+、Zn2+、Mg2+等, 干擾礦質離子的吸收轉運[8], 致使葉綠體蛋白中心離子組成發生變化而失去活性, 與此同時破壞、抑制葉綠素合成酶如原葉綠素酸脂還原酶的活性[27], 阻礙葉綠素的合成, 增強葉綠素分解酶的活性, 致使葉綠素分解加快, 加之郝玉波等[8]研究發現在砷脅迫下, 玉米葉綠體雙層膜部分遭到損壞甚至消失、多數基粒片層斷裂等現象表明砷脅迫引發葉綠體超微結構損傷。從而影響植物光合作用,造成植物葉片發黃, 生長遲緩。

3.2 對膜脂過氧化程度的影響

已有研究表明砷能引發植物的氧化脅迫, 打破細胞內固有自由基代謝平衡, 導致細胞膜脂質過氧化程度加重, 質膜結構遭到破壞, 失去原有選擇性,并進一步影響植物的光合、呼吸等生理功能, 最終影響蛋白質、核酸、脂質等生物大分子的代謝過程[28]。廖寶涼等[29]研究亞砷酸鈉對水稻幼苗生長的影響, 結果表明當培養液中砷(NaAsO2)的濃度約大于0.1×10-6時, MDA含量明顯升高。樊香絨等[22]研究中國蓮幼苗抗氧化系統對砷脅迫的響應結果顯示: 當As(Ⅲ)處理濃度達到10 μmol/L時, 幼苗組織內的MDA含量顯著高于對照組。在本實驗中,處理組MDA含量均高于對照組, 但當As (Ⅲ)處理濃度低于500 μmol/L時, MDA含量較對照組差異不顯著, 當處理濃度升高至500 μmol/L時, MDA含量顯著高于對照組, 表明隨著砷處理濃度的不斷升高,黃花水龍無菌苗葉片細胞受到As(Ⅲ)脅迫引起的氧化壓力加劇, 細胞膜脂過氧化程度隨砷濃度增加而加重, 細胞膜系統受到破壞。

3.3 對滲透調節物質的影響

可溶性蛋白、可溶性糖都是植物細胞滲透壓的重要調節物質, 可維持植物細胞和內環境的穩定。當植物滲透勢較低時, 可通過提高可溶性蛋白質含量用以調節細胞滲透壓使之維持正常水平[11]?？扇苄蕴遣粌H是高等植物光合作用主要產物, 也是衡量碳運輸轉化代謝過程的重要生理指標, 逆境條件下參與滲透調節, 與植物的抗性有密切關系。曾小飚等[30]研究砷脅迫對麻風樹幼苗顯示低濃度砷處理可溶性蛋白含量升高, 當處理濃度升至60 mg/L,可溶性蛋白含量逐漸下降, 樊香絨等[22]研究砷脅迫對中國蓮幼苗抗氧化系統的影響也顯示As (Ⅲ)在低濃度時能夠顯著增加可溶性蛋白質的含量, 而在濃度達到10 μmol/L 時可溶性蛋白質的含量有所降低。本實驗結果顯示, 黃花水龍無菌苗可溶性蛋白含量隨砷作用濃度升高呈先升后降趨勢, 說明低濃度的砷對可溶性蛋白質具有激活功能, 以適應環境中砷的脅迫; 隨著砷濃度的逐漸增大, 則轉為一定的抑制作用, 對機體造成損害, 影響其生長發育。

郝玉波等[8]的研究結果顯示在低濃度砷處理下, 玉米可溶性蛋白含量較對照組有所降低, 而后隨著處理濃度升高(高于2 mg/L)而顯著升高。在本實驗結果中可溶性糖隨砷處理濃度升高也呈先降后升趨勢, 原因可能是由于黃花水龍在砷逆境中需要一定適應時間, 也可能是低濃度砷激活植物某些生理活動, 使得黃花水龍無菌苗生理代謝旺盛, 需要更多光合產物滿足生長需求。而隨著砷作用濃度升高, 導致植物體內高分子碳水化合物如淀粉等的合成受到抑制, 并促進了其分解, 從而促進合成更多的可溶性糖, 維持體內滲透壓平衡, 抵御砷作用逆境下的毒害作用, 提高植株抗逆性。常思敏等[9]研究砷對烤煙碳代謝影響的結果表明砷處理抑制了烤煙碳的同化和蔗糖的合成, 促進了蔗糖的分解,不利于碳向積累方向轉化, 可溶性糖含量不斷升高。薛艷等[17]研究鎘和鉛脅迫下黃花水龍可溶性糖含量呈逐漸降低趨勢, 表明同一植物面對不同重金屬脅迫反應機制有所不同。

3.4 對抗氧化酶活性的影響

在砷脅迫逆境下, 導致植物體內活性氧代謝平衡遭到破壞, 從而引發黃花水龍無菌苗產生氧化應激, 通過提高機體內抗氧化酶SOD、POD和 CAT活性, 維持細胞內活性氧自由基正常水平。其中超氧化物歧化酶(SOD)作為防御活性氧的第一道防線,是生物體內最重要的清除活性氧自由基的酶類, 其以氧自由基為底物, 通過催化超氧陰離子(O2·-)降解為雙氧水(H2O2)及氧氣(O2), 從而終止由超氧負離子造成的一系列生物毒損傷, 保護生物膜。在本實驗中, SOD活性隨砷濃度的增加呈先升后降的趨勢,表明低濃度砷脅迫激活植物抗氧化系統, 增強自由基清除能力,從而減輕氧化損傷, 但同時SOD活性升高導致H2O2含量增加, 引發POD和CAT活性增強,用于清除多余的H2O2。而在高濃度砷脅迫下,逆境造成的傷害超出黃花水龍無菌苗的承受能力,抗氧化酶活性均有所降低, 朱云集等[10]、袁敏等[31]也有相似的結果。

綜上, 本實驗對在無機三價砷脅迫下黃花水龍無菌苗的葉綠素、丙二醛、可溶性蛋白、可溶性糖、抗氧化酶SOD、POD和CAT含量進行測定, 結果表明黃花水龍無菌苗在砷脅迫環境中生長, 其主要生理指標中葉綠素、可溶性蛋白含量以及抗氧化酶SOD、POD和CAT活性隨砷濃度增加均表現出“低濃度促進高濃度抑制”趨勢, 丙二醛含量持續升高, 可溶性糖含量先降后升, 說明低濃度的砷對黃花水龍產生毒害作用較小, 隨著處理濃度升高,砷引發氧化脅迫對黃花水龍造成不可逆的損傷, 膜脂過氧化程度加劇, 細胞生長和光合作用都受到抑制。以上研究結果顯示黃花水龍對于砷污染水體修復具備一定的應用潛力, 由于黃花水龍對水體中的N、P也有較好的去除效果, 因而可將黃花水龍作為砷污染下富營養化水體凈化的修復植物。