彗星電泳檢測草胺磷對蚯蚓體腔細胞DNA的損傷

張來軍，陳永敢，王鳳琴

（1. 海南熱帶海洋學院水產與生命學院/海南省兩棲爬行動物研究重點實驗室，海南 三亞 572022；2. 隴東學院生命科學與技術學院，甘肅 慶陽 745000）

【研究意義】草胺磷（glufosinate ammonium，GA）屬膦酸類除草劑，是谷氨酰胺合成抑制劑，具有殺草譜廣、低毒、活性高、部分傳導性和環境相容性好等特點，常用于果園、葡萄園、非耕地防除雙子葉及禾本科雜草。在大田里，草胺磷降解迅速，半衰期為2.30～2.93 d，衍生物為3-甲基膦-丙酸（MPP）和2-甲基膦-乙酸（MPA）［1］，這一過程與溫度密切相關。草胺磷的轉基因作物有馬鈴薯［2］、水稻［3］、棉花［4］、小麥［5］、煙草［6］等，使草胺磷擁有巨大的潛在商業市場。但除草劑的廣泛使用對土壤及整個生態系統影響深遠，科學合理使用草胺磷，需要從整個環境全面考慮，評估其在生態環境中的安全性。

【前人研究進展】據研究報道，施用草胺磷的麥田土壤微生物中，細菌和放線菌數量隨著草胺磷濃度的增加呈先增加后減少趨勢［7］。在高溫高濕的熱帶，草胺磷對土壤細菌和放線菌種群的生長表現為低劑量促進、高濃度抑制；對土壤真菌種群的生長表現為抑制作用［8］。葡萄園用草胺磷除草劑比機械除草平均減少了53%的葡萄根菌根化，但是土壤中蚯蚓或凋落物分解不受除草劑影響［9］。小鼠在出生前后暴露于低劑量草胺磷可誘發自閉癥樣表型［10］，小鼠圍產期暴露于草胺磷會通過破壞細胞骨架而影響神經發生和神經母細胞遷移［11］。王彥華等［12］研究了22種常用除草劑對蚯蚓的急性毒性，其中草胺磷染毒24 h的LC50值大于1 258 μg/cm2，將其歸入微毒級。關于草胺磷對環境中動物的影響研究報道并不多。

【本研究切入點】蚯蚓是土壤生態系統中最重要的一類無脊椎動物，是土壤生態毒理學最常用的實驗材料，用于重金屬污染［14］、油類污染［15］及農藥污染［16］等生態毒理學相關研究，以及污泥處理、土壤重金屬積累［17］等生物修復探索。然而草胺磷在亞急性毒性下對蚯蚓的細胞毒性研究還未見報道。單細胞凝膠電泳（single cell gel electrophoresis, SCGE）又名彗星電泳，可用于檢測各種理化因子作用于細胞后引起的DNA鏈斷裂，并在統計學基礎上評估損傷程度［13］，是一種快速、靈敏、可靠的定量DNA損傷及修復的方法，被廣泛應用于醫學、生物學、毒理學和環境生物監測等領域?！緮M解決的關鍵問題】本研究采用彗星電泳技術，研究不同濃度草胺磷脅迫蚯蚓24 h和96 h后，蚯蚓體腔細胞DNA損傷程度，揭示草胺磷對土壤動物蚯蚓的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）購自河北石家莊晉州市蚯蚓養殖場。在室內預養約2～4周，挑選體重為400～500 mg、大小較一致的健康蚯蚓進行試驗。

供試草胺磷乳液（濃度200 g/L），由山東潤揚化學有限公司生產；正常熔點瓊脂糖（NMA，西班牙）、低熔點瓊脂糖（LMA）、Triton X-100、肌氨酸鈉、DMSO，上述試劑均為Amresco分裝產品；自制蚯蚓體腔細胞提取液（EM，含5%乙醇、95%生理鹽水、2.5 mg/mL Na2EDTA、10 mg/mL 愈瘡木酚甘油醚，pH7.3）、裂解液（ 含2.5 mol/L NaCl、0.1 mol/L EDTA、0.01 mol/LTris、1%肌氨酸鈉、1% Triton X-100、10%DMSO，pH 10）、電泳緩沖液（ 含0.3 mol/L NaOH、1 mmol/L EDTA，pH＞13）。試驗儀器有倒置熒光顯微鏡（DMI 3000，德國Leica 公司）、電泳儀（Tanon EPS 300，上海天能科技有限公司）、電泳槽（DYCP-33A，北京六一生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 經過預試驗后，設置脅迫24 h和96 h的草胺磷濃度梯度分別為0、37.5、75、150、300 mg/L 和 0、18.75、37.5、75 mg/L，每個濃度處理3次重復。

將蚯蚓在25℃、濕度65%、暗環境下清腸24 h。用去離子水將供試農藥按試驗設計濃度稀釋，同時用去離子水作為空白對照。分別將不同濃度的草胺磷加入墊有濾紙的培養皿中。將清腸后的蚯蚓洗凈，用濾紙吸干水分。在每一個濃度梯度中放入5條蚯蚓，蓋上培養皿蓋子，用封口膜封口，留1 cm長的縫隙做通氣孔。將培養皿置于室溫25℃、濕度65%的環境中黑暗培養。脅迫時間為96 h的蚯蚓需要每天重新更換相同濃度的草胺磷溶液，以消除蚯蚓自身代謝產物的影響。分別于脅迫24 h和96 h后，提取蚯蚓體腔細胞，用于彗星電泳。

1.2.2 蚯蚓體腔細胞的提取 根據Eyambe等［18］的方法稍改動后提取蚯蚓體腔細胞。脅迫結束后，將不同濃度草胺磷處理的蚯蚓隨機選取2條，剪取其身體中后部約2 cm長的軀干，移入2 mL離心管中，加入400 μL 4℃的體腔細胞提取液；1 min后，再加入1.5 mL 4℃磷酸鹽緩沖液（PBS），棄沙蠶，得到體腔細胞。于800～1 000 r/min下離心3 min，棄上清，兩管合為一管，重新加入1 mL PBS。顯微鏡下觀察細胞活力，調整細胞密度，準備電泳。

1.2.3 彗星電泳 按Zhang等［19］改良方法進行彗星電泳。將細胞懸液和1%低熔點膠按1∶1體積混合均勻，鋪在預處理后的載玻片上，4℃放置5 min，使瓊脂糖凝固。將鋪好膠的載玻片放入新鮮配制的裂解液中裂解90 min。蒸餾水沖洗后，將載玻片放入電泳緩沖液中，變性解旋20 min，電泳20 min（26 V，300 mA）。用400 mmol/L Tris緩沖液（pH 7.5）中和3次，每次中和5 min，從裂解到中和的所有過程需在4℃下進行。將載玻片置于20 μg/mL EB中染色20 min后，于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 數據處理

從每個濃度草胺磷處理隨機取大約50個細胞，用CASP軟件進行分析，可得到多項反應DNA損傷程度的參數。本試驗選用頭部DNA含量（HDNA%）、尾部DNA含量（TDNA%）、尾長（TailLength，TL）、尾矩（TailMoment，TM）和Olive尾矩（Olive TailMoment，OTM）5個最常用的參數作為DNA損傷程度的評價指標。采用Spss13.0 對數據進行單因素方差分析（ANOVA）和Dunnett多重比較，對各濃度處理與對照之間進行差異顯著性分析，顯著性以3個水平表示，分別為P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001。

2 結果與分析

2.1 草胺磷脅迫24 h對蚯蚓體腔細胞DNA的影響

由表1可知，與空白對照比較，37.5、75、150、300 mg/L草胺磷脅迫處理24 h蚯蚓的TDNA%、HDNA%、TL、TM和OTM值都有顯著差異（P＜0.05），其中TDNA%、TL、TM、OTM隨草胺磷濃度升高而提高，HDNA%隨草胺磷濃度升高而降低，且草胺磷濃度越高，差異越顯著。兩個低濃度（37.5、75 mg/L）處理間各參數值變化未達到顯著水平，但與高濃度（150、300 mg/L）處理相比，差異均達到顯著水平（P＜0.05）。草胺磷質量濃度最高達300 mg/L時，與空白對照比較，TDNA%提高了2.8倍（P＜0.001）、TL提高了2.2倍（P＜0.01）、TM提高了5倍（P＜0.001）、OTM提高了3.6倍（P＜0.001）、HDNA%則降低了1.48倍（P＜0.001）。因此，在24 h的短期脅迫下，草胺磷使蚯蚓體腔細胞DNA產生了明顯的損傷，草胺磷濃度越高，損傷越嚴重；草胺磷濃度與蚯蚓體腔細胞DNA損傷程度彼此間呈顯著的劑量-效應關系。

表1 不同濃度草胺磷脅迫蚯蚓24 h后彗星電泳各項參數比較Table 1 Comet assay results of earthworms under different concentrations of glufosinate stress for 24 h

2.2 草胺磷脅迫96 h對蚯蚓體腔細胞DNA的影響

降低草胺磷脅迫濃度，延長脅迫時間至96 h后，提取蚯蚓體腔細胞進行彗星電泳，結果見圖1。

由表2可知，與空白對照比較，18.75、37.5、75 mg/L草胺磷脅迫處理96 h蚯蚓的TDNA%、TL、TM和OTM值隨草胺磷濃度升高而提高（P＜0.05），HDNA%值隨草胺磷濃度升高而降低（P＜0.05）；草胺磷濃度越高，差異越顯著。最低草胺磷濃度（18.75 mg/L）脅迫下，TDNA%、TL、TM和OTM分別為空白對照的1.48、1.17、1.66、1.4倍，HDNA%降低1.22倍（P＜0.05）。因此，草胺磷脅迫96 h對蚯蚓體腔細胞DNA產生了明顯損傷，濃度越高，損傷越嚴重；草胺磷濃度與蚯蚓體腔細胞DNA損傷程度呈現顯著的劑量-效應關系。

表2 不同濃度草胺磷脅迫蚯蚓96 h后彗星電泳各項參數比較Table 2 Comet assay results of earthworms under different concentrations of glufosinate stress for 96 h

37.5、75 mg/L草胺磷脅迫蚯蚓24 h時，兩組彗星電泳參數值變化并不顯著；延長脅迫時間至96 h后，兩個處理間各項參數值差異均達到顯著水平（P＜0.05），反映了草胺磷濃度越高，脅迫時間越長，對蚯蚓的傷害越嚴重。

3 討論

2016年草胺磷成為全球第二大除草劑，銷售額達到6.6億美元；同時歐盟對活性物質草胺磷再評審也將不再批準，主要原因是不能排除草胺磷對哺乳動物潛在的危害風險，也不能排除對非靶標節肢動物的影響［20］。除草劑濫用或長期以抗除草劑作物為主的廣譜除草劑農業管理，不僅減少植物的多樣性和豐富性，影響了節肢動物和其他農田動物［20］，甚至使一些持效期長、殘留久的除草劑在土壤中富積量越來越高，對后茬作物造成毀滅性的損失［21-22］。草甘膦在過去20年曾廣泛使用，抗除草劑作物連續多年持續輪作，使得全世界出現了至少34種抗草甘膦雜草［20］。工業上仍然在開發帶有抗除草劑基因的轉基因作物。研究發現，一味增加農藥使用強度并不能有效抑制農作物病蟲害的發生，反而是作物多樣性的增加可減少農作物病蟲害的發生面積，因為作物多樣性保障了生態系統的自動調節能力［23］。因此，除草劑的使用推廣需要對整個環境作全面考慮，以嚴謹的態度評估其在生態環境中的安全性。

本試驗在室溫、避光、溫濕度恒定的條件下采用彗星電泳技術反映草胺磷對蚯蚓體腔細胞的影響，結果發現草胺磷引起蚯蚓體腔細胞的損傷，在一定范圍內，草胺磷濃度越高，脅迫時間越長，損傷越嚴重。蚯蚓體腔細胞DNA的損傷與草胺磷濃度間呈明顯的正相關關系，該結果對草胺磷的安全使用和生態環境保護具有一定的指導意義。但由于草胺磷在大田或果園實際應用過程中，溫度、濕度和光照以及土壤微生物等的作用，與在實驗室環境的應用效果差距很大，因此草胺磷對所施用的環境中蚯蚓及其他動物的實際毒性影響還需要進行廣泛的研究和探索。

4 結論

本試驗結果表明，草胺磷對蚯蚓體腔細胞產生損傷，草胺磷濃度越高，脅迫時間越長，損傷越嚴重。此外，彗星電泳對反映草胺磷濃度與蚯蚓體腔細胞DNA損傷程度兩者關系靈敏快捷，是揭示彼此之間相互關系的有效實驗手段。