槐米中蘆丁的提取工藝優化及檢識

張 依 周澤純 全錦秋 蒙蘭花

1.廣州醫科大學藥學院，廣東廣州 511436；2.廣州醫科大學公共衛生學院，廣東廣州 511436

槐米為豆科植物槐（Sophora japonica L.）的干燥花蕾，始載于《日華子本草》，《神農本草經》中將其列為上品，現列在國家衛生部第一批藥食同源名單中，有凉血止血，清肝瀉火等功效[1]?，F代藥理研究表明槐米具有保護血管[2-3]，改善糖尿病[4]，抑制人鼻咽癌細胞CNE1 增殖并誘導其凋亡[5]，抑菌抗氧化[6-7]和抑制黑色素生成[8-9]等作用。中國是槐米的原產地，世界上98%的槐米來自中國[10]?；泵字懈缓J丁和槲皮素等黃酮類成分，其中主要活性成分為蘆丁。醫藥工業中常以槐米為主要原料提取蘆丁，銷往日本，東南亞和歐美等國家和地區[11-12]。綜上，中藥槐米及其活性成分蘆丁具有較高的藥用、食用、保健保養和研究價值。

蘆丁為黃酮苷，分子中具有較多酚羥基，顯弱酸性，易溶于堿液，酸化后又能游離析出?；泵字刑崛√J丁常用的方法有回流提取法，堿提取酸沉淀法，超聲提取法，水煎煮法[13-16]等，回流提取法和水煎煮法簡單方便，成本低，但蘆丁的提取率低；超聲提取法操作簡便，作為輔助方法在中藥提取方面有廣泛應用[17]。本研究探討了從槐米中提取蘆丁的提取方法，在此基礎上考察了堿液的pH值、料液比和靜置時間等因素對蘆丁提取率的影響，優化了槐米中蘆丁的提取工藝，并對自提的蘆丁進行了紫外（UV）檢識和高效液相色譜（HPLC）檢識。旨在為今后深入開發和利用槐米資源提供數據支持。

1 儀器及試劑

1.1 儀器

TLE303E電子天平、FE20實驗室PH計[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SYU-7-200T超聲波儀、SHZ-D（Ⅲ）循環水多用真空泵、DHG-208B烘箱（鄭州生元儀器有限公司）；UV1900紫外分光光度計、LC-20A HPLC高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 試劑

甲醇（Merck，色譜純）；冰乙酸（西亞試劑，色譜純）其他試劑均為分析純。

蘆丁標準品（廣州市齊云生物科技有限公司，批號：181027，純度＞98%）。

槐米（產地：河北；茂名市東亞藥業飲片有限公司）由廣州醫科大學生藥學教研室鑒定。用高速多功能粉碎機粉碎，過100目篩，置棕色廣口瓶中，于4℃冰箱保存待用。

2 蘆丁的提取條件優選

2.1 提取方法對蘆丁提取率的影響

平行稱取四份槐米粉末各20g于1000mL燒杯中，各加入400mL沸水溶解，邊攪拌邊小心加入飽和石灰水調節pH至9，分別以超聲輔助（70℃，40kHz，200W）提取30min；超聲輔助（70℃，40kHz，200W）提取30min，提取2次；電熱套加熱回流（130℃，微沸）30min，超聲輔助（70℃，40kHz，200W）提取30min；電熱套加熱回流（130℃，微沸）60min四種方法提取蘆丁，趁熱抽濾，取濾液加濃HCL調節pH至3，靜置24h后抽濾，取濾渣，60℃烘干，得蘆丁粗提取物。每種方法平行操作3次，計算平均提取率。

表1 提取方法對蘆丁提取率的影響（n=3）

結果見表1，單純超聲提取時，提取次數對蘆丁的提取率增加并無提高。相同時間內，單純超聲提取或單純加熱回流提取時，超聲提取時槐米中蘆丁的提取率略高于加熱回流提取時的提取率，但兩種方式的提取率均不高。在以上提取方式的基礎上，與先加熱回流30min，再超聲輔助提取30min的提取方式相比，后者提取率有較大的提高。綜上，在堿提酸沉的基礎上，選用先電熱套加熱回流（130℃，微沸）30min，再超聲輔助（70℃，40kHz，200W）提取30min的方法時蘆丁的提取率最高。其原理是利用超聲波震動所產生的空化效應、機械效應、湍流效應、界面效應和熱效應等物理作用，提高中藥槐米細胞的通透性，加速槐米細胞壁破裂，使溶劑滲透到槐米的細胞內或使槐米細胞內的化學成分擴散到細胞外[17-18]，從而加速有效成分的溶出。加熱回流法和超聲輔助提取技術兩者相結合，能明顯縮短提取時間，有利于槐米中的蘆丁快速且高效提出。

2.2 堿液pH值對蘆丁提取率的影響

平行稱取五份槐米粉末各20g于1000mL燒杯中，各加入400mL沸水溶解，邊攪拌邊小心加入飽和石灰水分別調節pH至7、8、9、10、11。采用加熱回流30min，再超聲輔助提取30min的方法提取蘆丁，趁熱抽濾，取濾液加濃 HCL調節pH至3，靜置24h后抽濾，取濾渣，60℃烘干，得蘆丁粗提取物。每種條件樣品平行3份，計算平均提取率。

圖1 pH值對蘆丁提取率的影響

圖1結果表明，同樣條件下，控制堿液pH在7或11附近，蘆丁的提取率很低；弱堿狀態下，蘆丁提取率隨著控制堿液pH升高而大幅提高；至pH為8時，蘆丁的提取率達到最高，隨后緩慢下降。弱堿條件下槐米溶液中的果膠、黏液質等水溶性成分易生成鈣鹽沉淀，適當濃度的堿液對槐米中蘆丁有增溶作用。綜上，選擇控制堿液pH為8有助于提高蘆丁的提取率。

2.3 料液比對蘆丁提取率的影響

平行稱取五份槐米粉末各20g于1000mL燒杯中，分別加入100、200、300、400、500mL不同料液比的沸水溶解，邊攪拌邊小心加入飽和石灰水調節pH至8。采用加熱回流30min，再超聲輔助提取30min的方法提取蘆丁，趁熱抽濾，取濾液加濃 HCL調節pH至3，靜置24h后抽濾，取濾渣，60℃烘干，得蘆丁粗提取物。每種條件樣品平行3份，計算平均提取率。

圖2結果表明，蘆丁提取率隨著料液比的增加而增加，在料液比為1∶20（g/mL）時達到最大提取率，隨后緩慢下降。因此，選取20g槐米粉末樣品加入400mL沸水進行提取，即料液比為1∶20（g/mL）時為最優條件。

圖2 料液比對蘆丁提取率的影響

2.4 靜置時間對蘆丁提取率的影響

平行稱取五份槐米粉末各20g于1000mL燒杯中，各加入400mL沸水溶解，邊攪拌邊小心加入飽和石灰水調節pH至8。采用加熱回流30min，再超聲輔助提取30min的方法提取蘆丁，趁熱抽濾，取濾液加濃HCL調節pH至3，分別靜置3、6、12、18、24h后抽濾，取濾渣，60℃烘干，得蘆丁粗提取物。每種條件樣品平行3份，計算平均提取率。

圖3 靜置時間對蘆丁提取率的影響

圖3結果表明，堿提酸沉后抽濾得到的蘆丁粗提取物，在靜置3～6h內提取率緩慢增加，隨著靜置時間的增長，蘆丁提取產率不斷提高，到24h，即靜置過夜時，達到最高。中藥槐米經堿提酸沉后，需要經一定的時間，讓蘆丁充分沉淀析出。

3 蘆丁的檢識

3.1 蘆丁的紫外（UV）檢識

取蘆丁對照品甲醇溶液和自提蘆丁甲醇溶液，用紫外分光光度計在200～600nm的波長范圍內進行掃描，結果如圖4。兩者紫外吸收光譜特征一致，均在峰帶Ⅰ（300～400nm）和峰帶Ⅱ（220～280nm）范圍內有特征吸收，這是因為黃酮類化合物存在桂皮?；氨郊柞；M成的共軛體系，其甲醇溶液在峰帶Ⅰ和峰帶Ⅱ范圍存在特征吸收。因此，從中藥槐米中提取的為蘆丁粗提物。

圖4 蘆丁對照品和自提蘆丁的紫外吸收光譜疊加圖

3.2 蘆丁的HPLC檢識

色譜條件：色譜柱為GL Sciences，InertSustain C18（250×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇：水（含0.1%醋酸）=60∶40；流速：1mL/min；柱溫：室溫；進樣量：20μL；檢測波長：254nm；分析時間：8min。

取空白甲醇溶液、蘆丁對照品溶液和自提蘆丁樣品溶液在上述色譜條件下進樣，記錄色譜圖。結果見圖5，蘆丁對照品溶液和自提蘆丁樣品溶液在同一保留時間出峰，且空白甲醇溶液無干擾，該方法專屬性好，自提蘆丁較純。

圖5 空白甲醇、蘆丁對照品、自提蘆丁樣品的HPLC分離色譜圖

4 討論

本研究利用蘆丁易溶于堿液，在酸液中又會沉淀析出的特性，用堿提酸沉法對槐米中的蘆丁進行提取。實驗得出：先電熱套加熱回流（130℃，微沸）30min，再超聲輔助（70℃，40kHz，200W）提取30min為最優提取方法。在此基礎上，堿液溶解時pH值為8，料液比為1∶20（g/mL），經酸沉淀后靜置時間為24h，為最優提取工藝。并用UV法和HPLC法對自提的蘆丁進行了檢識，結果表明自提的蘆丁較純。加熱回流法和超聲輔助提取技術相結合，能有效縮短中藥槐米中蘆丁的提取時間，增加提取率。綜上，優化提取工藝后槐米中蘆丁的提取率有明顯提高，該工藝操作簡便，儀器簡單，綠色環保，為進一步合理開發利用中藥槐米資源和工業化大生產提供數據支持。